骨移植理论与骨生长因子

胡蕴玉  李丹
一、骨移植
移植骨可发挥3种生理作用：（1）诱导成骨作用，即通过募集具有成骨潜能的细胞在局部诱导新骨形成。（2）骨传导作用，指移植骨作为支架引导来自受骨床的新生毛细血管、血管周围组织和骨原细胞长入移植骨，继之新骨沉积于其表面及周围。（3）移植骨是骨形成细胞的来源，特别是新鲜自体骨。各种植骨方法在不同程度上体现了其中一种或数种作用。骨移植依其材料来源可分为自体骨、同种异体骨、异种骨和人工骨。自体骨因兼有骨诱导活性和骨传导作用，且携有具成骨作用之骨髓细胞，成骨效果最好，故目前仍奉为“金标准”。但自体骨来源有限，且取骨增加患者痛苦，尤不适用于儿童和老人。同种异体骨来源也有限，如检疫不严还有传播肝炎和艾滋病的危险。异种骨移植近年受到重视，如有报道Kiel骨复合自体红骨髓移植取得满意效果，国内研制的重组合异种骨为异种骨的临床应用开辟了新的前景。人工骨特别是生物陶瓷类在骨科的应用受到瞩目，但单纯人工骨植入只能起支架作用，而并无诱导成骨活性。
1、自体骨移植
临床上自体骨多采自髂骨、胫骨和腓骨，分别提供松质骨、皮质骨和全骨。（1）非血管化自体移植骨因缺乏血供，大多数细胞死亡，仅表面0.1～0.3mm范围的少数细胞依赖受区组织液的弥散得以存活。移植骨内的骨原细胞主要来自骨膜和骨髓，故松质骨之成骨能力大于皮质骨。松质骨血运重建较快，早期以成骨活动占优势，死骨逐渐进行内部改建，被破骨细胞吸收，继之新骨内有红骨髓聚集，移植骨于是完全被新骨取代。松质骨常用于对移植骨强度无特殊要求时，可采取松质骨碎骨、全厚松质骨、髂骨外板和包括两侧骨皮质的髂嵴长条。常用的植骨方法有：外周薄片植骨、嵌入植骨、骨腔内充填骨和脊柱融合植骨术等。皮质骨血运重建较晚，早期有活跃的破骨活动，破骨活动和成骨活动交替进行，逐渐完成移植骨的修复。皮质骨适于提供功能性支持，胫骨、腓骨、股骨、桡骨和肋骨均可供骨，一般在胫骨内侧面取骨。常用的植骨方法有单侧上盖植骨术、双侧上盖植骨术、钢板加单侧上盖植骨术、嵌入植骨术和骨钉植骨术。全骨移植骨通常取腓骨的中1/3段或上1/2段，用于修复儿童长骨如尺、桡骨缺损。（2）血管化自体移植骨因带有自身的血供系统，不会发生骨坏死和吸收，只须与受区骨发生愈合，其修复过程类似新鲜骨折，无须经过爬行替代。移植骨血供可来自肌蒂或吻合血管。行带肌蒂骨瓣移植时，保留移植骨的肌肉附着部及骨膜，移植骨通过肌蒂滋养血管或知名血管供血。常用的有股方肌蒂骨瓣、缝匠肌股直肌蒂骨瓣移植术、带肌蒂腓骨段转移术和带肌蒂皮质骨片移植术。带血管自体骨移植适用于受骨床瘢痕多、局部循环差或常规植骨不易愈合时。带血管复合骨肌皮瓣移植可对皮肤、肌肉和骨复合缺损一次进行修复。常用方法有带血管髂骨游离移植、带血管腓骨游离移植和带血管肋骨游离移植，所用血管须有足够的长度和管径，起源及位置较恒定。
2、同种异体骨移植
与自体骨移植相比，同种骨材料来源较多，且因其具有天然结构、形状和强度，有一定的诱导活性，在骨移植中有其不可替代的地位。但同种骨移植如检疫不严有传播肝炎、艾滋病等疾病的危险。此外据报道，对人工关节置换术中切除的1146个股骨头进行病理检查，发现91例除骨关节炎外还有其它病变，包括软骨钙质沉着、缺血性坏死、骨瘤、恶性肿瘤、骨代谢疾病和炎症性关节炎，故建议凡进入骨库的异体骨材料均须经过组织学检查。
同种骨特别是新鲜同种骨，常引起免疫排斥反应，导致移植骨吸收而失败。此种免疫反应以活性淋巴细胞和细胞毒性抗体的产生为特征，细胞膜表面的糖蛋白是引起免疫反应的主要抗原成分，后者受主要组织相容性复合体（MHC）控制表达。受体对同种骨移植的免疫反应以细胞免疫为主，体液免疫不直接参与，但多数情况下受体循环中出现针对移植骨的特异性抗体。出现排异时干扰素和肿瘤坏死因子含量会增高，推测其在排异反应中可能起一定作用。为消除或减弱同种骨的抗原性，常采用各种物理、化学方法进行处理，常用且证明效果较好的方法有：（1）冷冻法：在-20～-196℃保存2w以上，可多少减弱其抗原性；（2）冷冻干燥法：冷冻至-85℃，在真空状态使水分升华干燥，其抗原性低于冷冻骨，且可在室温下长期保存；（3）脱钙法：多行部分脱钙处理，因其具有良好诱导成骨活性，并保有一定的机械强度。大段同种骨关节移植物可采用深低温或冷冻干燥法保存，冷冻前须用10%甘油等冷冻保护剂浸洗，尽可能保存软骨细胞。
冷冻、冻干和脱钙同种骨均已应用于临床。主要用于骨腔充填、骨段移植术、关节融合术和假体重建术等方面。脱钙骨经化学灭菌、提取抗原和自溶消化处理，消除了可溶性同种抗原，植入后骨形成比新鲜骨、冻干全骨或60钴辐照灭菌的冻干骨更多。
3、异种骨移植
动物骨来源广，避免了自体骨取骨可能引起的并发症，也无同种异体骨可能传播人类疾病的危险。但未经处理的异种骨移植后必然引起排斥反应，导致手术失败，是近百年来异种骨移植面临的主要难题。参与异种骨移植免疫反应的因素，包括特异性细胞免疫和体液免疫。曾采用冷冻、冻干和脱钙法处理异种骨，以消除其抗原性，均因效果不佳而不再使用。还曾使用各种脱蛋白骨，如Kiel骨、Oswestry骨和Bio-Oss骨，虽然抗原性极弱，但也丧失了诱导成骨活性而仅能起被动的骨传导和保护性支架作用。经如此处理的异种骨多以复合形式应用，如将Kiel骨复合自体红骨髓治疗包括假关节、良性骨肿瘤和创伤性骨缺损等多种伤病和关节融合术，疗效满意。但自体红骨髓来源有限，这种复合异种骨未能在临床推广应用。如何消除异种骨的抗原性同时保留其诱导成骨能力，是异种骨应用于临床必须解决的问题。国内胡蕴玉等研制的“重组合异种骨”，突破了异种骨处理的传统观念，对异种骨的抗原性和诱导成骨活性分别进行处理，即从异种皮质骨中提取BMP，将异种松质骨制成无抗原载体，然后将二者重新组合。小牛松质骨载体经脱脂、部分脱蛋白、表面脱钙和冻干等一系列处理，基本消除了抗原性，并保持了天然多孔结构，复合BMP后具有高效诱骨活性。小鼠肌袋模型实验表明，仅含0.5mg BMP的重组合异种骨，异位植入14d即有骨组织形成，28d后诱导产生成熟的骨组织。将其植入15mm兔桡骨缺损，4w后有新生骨软骨形成，16w缺损完全修复。临床上重组合异种骨用于治疗骨不连、骨缺损和难愈性骨折，疗效好，移植骨多在2～6个月愈合，无明显排斥反应。
4、人工骨
许多人工骨材料已被应用于骨重建，复合有成骨潜能的细胞或生长因子后效果较好，但其植入后的长期可靠性是一个问题。人工骨材料须能满足以下基本要求：（1）具有良好的生物相容性；（2）具有一定的机械稳定性；（3）有微孔结构，使新生骨组织得以长入；（4）其吸收速度与新骨生长速度大致保持同步；（5）易于加工成所需大小和形状。生物陶瓷和可降解高分子生物材料是目前常用的两大类人工骨材料。
生物陶瓷作为植入物能满足人工骨的一般要求，其优点是生物相容性好，缺点是机械性能较差，硬而脆，易断裂。根据植入物与受体骨组织界面所发生组织反应的类型，可将生物陶瓷分为4型：（1）近乎惰性的晶体生物陶瓷：无生物活性，植入后与骨组织之间形成纤维膜，易松动脱落。临床上得到广泛应用的是氧化铝，可用作人工髋关节假体部件。（2）多孔陶瓷：包括多孔多晶氧化铝和羟基磷灰石（HA）涂层的金属，其特点为呈生物惰性，但在骨组织长入其孔隙时却形成高度迂曲的界面，从而提供了机械稳定性。（3）表面活性陶瓷：包括生物活性玻璃（bioglass）、玻璃陶瓷（glass-ceramics）和羟基磷灰石，其化学组成与人体骨组织相近，可借助化学键直接与骨结合，即具有生物活性。近年研制出一种称为ceravital的玻璃陶瓷，与骨结合性能甚好，已成功地应用于脊柱外科和制造人工骨盆。HA陶瓷多与其它材料复合使用，如HA与自体骨、自体红骨髓、胶原、BMP、同种异体骨（脱钙骨基质或去抗原自溶脱钙同种骨）、煅石膏、聚合物和氧化铝陶瓷等复合，可克服HA缺乏骨诱导性和颗粒性材料成形困难的缺点。HA植入后不吸收。（4）可吸收的陶瓷：在宿主体内逐渐吸收而被形成的新骨替代，以磷酸三钙（TCP）为其代表。TCP之生物学特性与HA大致相同，其优于HA之处为植入后在体内缓慢降解吸收。现多用TCP作为载体复合各种生物活性因子使用，如TCP复合BMP，可发挥骨传导与骨诱导之双重作用。
可降解高分子生物材料生物相容性较好，可降解，且具有一定的机械强度，主要有聚乳酸（PLA）和聚乙醇酸（PGA），植入体内可作为支架起骨传导作用。但此二种材料降解后有酸性代谢产物积聚，特别是聚乳酸，可在体内形成无菌性窦道。利用此种材料较理想的降解速度，用以作为载体与具强诱导成骨能力的生长因子结合制成复合材料，比其它人工骨具有更多优点。
二、骨生长因子
生长因子能促进细胞增殖、分化和细胞外基质合成，对骨折修复的启动、发展、调控及改建起重要作用。鉴于此，应用生长因子试图促进骨折愈合就是很自然的了，而生长因子动物实验和临床应用结果也表明，生长因子用于骨折延迟连接或骨不连的治疗确有良好效果。虽然有许多生长因子参与调节骨折愈合，但目前只对少数几种的作用有所了解，其中研究较多的是骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP)、β转化生长因子（transforming growth factor β，TGF-β）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF)胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）和血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF)。这几种因子由炎症细胞、成骨细胞和软骨细胞合成，在骨折愈合的整个期间均有表达。
1. BMP
由动物骨提取的天然BMP是几种不同分子量蛋白质的混合物，其临床应用在80年代末就有报道。Urist首先将BMP用于难愈性骨不连的治疗。其后Johnson等将高度浓缩的人BMP（内含BMP-2、BMP-4和OP-1）复合非胶原蛋白和去抗原异体骨植入骨折部位，治疗28例骨不连与骨缺损，其中26例（93%）一次治愈，2例经再次手术植入BMP也治愈。另一组47例胫骨和股骨不连接，植入天然BMP后均达到骨愈合。国内用天然牛BMP复合去抗原牛松质骨制成“重组合异种骨”，治疗骨不连和骨缺损，效果也很好。天然BMP产量毕竟有限，应用重组DNA技术生产的BMP(如rhBMP)与天然提取物相比，具有产量大、纯度高的优点，为广泛应用于临床提供了实际可能。现已从牛骨分离出7种BMP，并已用重组DNA技术表达了相应的人BMP，其中BMP-2和BMP-7(成骨蛋白-1,OP-1)研究较为透彻，已有关于临床应用的报道。
BMP-2：BMP-2参与骨髓中祖细胞向成骨细胞的分化，在离体条件下可诱导成骨细胞前体细胞向较为成熟的类成骨细胞分化，同时抑制其肌源性分化。复合脱钙基质载体之rhBMP-2可在大鼠体内诱导骨形成，而在小鼠，植入无载体之rhBMP-2也导致骨形成。rhBMP-2可诱导结构性骨形成修复大鼠股骨节段性缺损，修复效果取决于剂量大小，而加入骨髓则可达到100%的愈合率。rhBMP-2复合胶原载体以外置植骨形式贴附于兔尺骨截骨部位，与单植入胶原载体及截骨后未予处理之对照相比，X线和生物力学测试均显示植入rhBMP-2 后骨愈合明显加快；3w后rhBMP-2组7/10有骨性桥接，而对照则无；4w后其抗扭强度相当于对照6w后之强度。羊股骨2.5cm节段性缺损植入复合胶原载体之rhBMP-2获得大致相同的结果：1个月后即有新骨形成，4个月后去除内固定，此时断端间已有骨性连接，骨矿质含量与正常股骨相仿，1年后新皮质骨形成和髓腔再通接近完成。组织学研究表明，继软骨内骨化之后，完全按正常顺序发生塑形和改建，新骨形成完全是一个可以预测的过程。rhBMP-2用于脊椎融合术也取得良好效果：在狗外后侧横突融合模型，植入rhBMP-2后3个月即有坚固的大块融合，而自体骨移植8个月后也仅有些微融合。目前有很多单位在进行用rhBMP-2治疗骨折的临床研究，但结果都是初步的。据来自美国4个大创伤中心的报道，12例用髓内钉或外固定器固定的II、IIIA和IIIB度开放性胫骨骨折植入复合胶原载体之3.4mg或6.8mg rhBMP-2，9例（75%）一次性治愈，3例需二次植骨。术后2例出现抗BMP-2之抗体。用rhBMP-2复合胶原载体修复牙槽嵴缺损，所诱导的新骨量（高度、宽度）与自体骨移植相仿，便于安装义齿并承受功能载荷。rhBMP-2之安全性已通过检定，美国食品与药品管理局（FDA）批准rhBMP-2临床试用治疗胫骨骨折和骨缺血性坏死。
BMP-7（OP-1）：OP-1可刺激成骨细胞系细胞增殖和分化。在成骨细胞原代培养中加入OP-1可增加碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙素合成，促进细胞外基质矿化。将复合胶原载体之rhOP-1植入大鼠皮下可引起一系列细胞反应，导致功能齐全的新骨形成。兔尺骨1.5cm缺损植入复合胶原载体之rhOP-1，8w后所有缺损均达到完全愈合；形成之新骨主要为板层骨，可见新生骨皮质和外观正常的骨髓成分；生物力学测试表明，其平均抗扭强度与正常骨相仿。在灵长类（非洲绿猴）尺骨和胫骨缺损模型，植入rhOP-1后的骨愈合率和愈合质量甚至优于自体骨移植。术后2～3w，缺损中出现分散的钙化组织岛，以后融合并改建为外观正常的骨桥接填充缺损；4～8w新骨改建基本完成；12w愈合的缺损显示致密的板层骨和少量编织骨，新皮质改建完善，髓腔中含具有功能的骨髓成分。rhOP-1用于狗外后侧脊椎融合模型，6w即产生稳定融合，融合块有很好的抗扭转稳定性，12w完全融合；而自体骨移植26w才发生完全融合，自体骨融合之抗扭强度在各个时点均不如OP-1。将rhOP-1涂布于人工假体表面，可在假体-骨界面间隙诱导大量新骨形成，加强金属假体与骨组织之结合。
关于rhOP-1的临床应用陆续有报道，特别是用于治疗棘手的胫骨骨折不连接，初步结果令人鼓舞。如一组122例124处胫骨骨折不连接，植入与牛胶原载体复合之OP-1或自体骨。初步结果表明，OP-1治疗骨不连的效果与自体骨相仿，但两种方法均未达到100%的治愈率。另一组97例胫骨骨折不连接，50例用OP-1治疗，47例行自体骨移植，结果OP-1之成功率为62%（31/50），自体骨为66%（31/47），但自体骨组骨髓炎之发生率较高。
生长因子为引起靶细胞的反应，需要有较长的作用时间，因此载体的选择很重要，BMP尤其如此。载体起支架作用，为BMP提供机械支持，构建适当的释放系统，避免生长因子的流失，也便于靶细胞附着。更重要的是，良好的载体可增强BMP的骨诱导作用。在小鼠肌袋实验中，1～2mg BMP是诱导骨组织形成的最低剂量，但将本无诱导成骨效应的0.5mg BMP复合去抗原松质骨（残留部分胶原基质）后，同样能诱导软骨和骨形成，并显示正常的分化过程。
2. TGF-β
使用外源性TGF-β的确可促进骨缺损修复。在兔颅骨缺损模型，给予外源性TGF-β促进了成骨细胞的征集和增殖，骨基质迅速沉积，骨改建正常进行；不给予TGF-β则缺损不能愈合。将TGF-β注入小鼠股骨骨膜下，可启动骨及软骨生成过程，骨膜下可见新生软骨和骨组织，存在膜内成骨及软骨内成骨两种成骨方式。大鼠骨膜下注射TGF-β也产生类似结果，增生组织中软骨/骨组织之比率与TGF-β剂量有关，较大剂量有利于软骨形成，TGF-β2促使软骨增生作用比TGF-β1强。天然人TGF-β可促进大鼠胫骨骨折的愈合，且呈剂量依赖关系，给予较大剂量（40ng）之TGF-β后，骨痂直径及断裂载荷均有增加。兔胫骨骨干截骨用钢板固定后，植入一渗压泵持续在骨折局部释放TGF-β，结果骨痂体积及抗弯强度均显著增加。狗桡骨缺损给予TGF-β（复合适当载体或通过渗压泵）也获得类似结果。一般来说，TGF-β促进骨愈合和再生的作用较BMP为弱，但因目前尚未做到TGF-β型别（TGF-β1～TGF-β5）选择、给药时间和释放方法的优化，故难以定论。
3. FGF
外源性bFGF可加速骨折愈合。在大鼠骨折模型中，给予外源性bFGF可刺激血管形成，骨痂体积和矿质含量增加，但如持续输注，则将延迟骨化的启动，提示bFGF在骨折修复的早期可能有刺激骨形成的作用。据推测，bFGF作用于骨诱导初期之一或数个环节，从征集炎症细胞和干细胞开始，以软骨形成告终，既然软骨数量增加，诱导后期骨形成量随之增加。将bFGF复合透明质酸酯注射于大鼠顶骨骨膜下，3d后骨膜显著增厚，7d后骨膜内有编织骨形成，14d骨形成量显著增加。在兔腓骨截骨模型，在骨折部位一次性注入复合透明质酸酯之bFGF（20～200ug），与对照相比，骨痂和新骨体积增加，成骨细胞数量和活性增加，骨的机械强度也有所提高，整个过程按骨折愈合之正常顺序进行。应用复合载体之bFGF治疗兔股骨10mm缺损，也可改善缺损之愈合情况。给大鼠静注bFGF可刺激体内各部位骨骼成骨细胞增生和骨内膜新骨形成。已证明bFGF对成纤维细胞和前成骨细胞有强大促分裂作用，可增强细胞外基质的骨钙蛋白基因表达，但对已分化的成骨细胞作用不大。bFGF的骨诱导作用与剂量大小有关。在大鼠胫骨骨折模型，植入8～200ng可增加骨钙含量78%，而剂量增大至1900ng则反而抑制骨诱导，软骨细胞密度和骨化指数均有所降低。剂量甚大时移植骨中无新骨组织长入，而是被大量纤维组织穿透，这可能是由于高浓度bFGF对成纤维细胞的作用较其对成骨细胞前体细胞作用更强。还有证据表明，过量bFGF之所以抑制骨形成，是由于抑制成骨细胞中I型胶原基因的表达。
在离体条件下，bFGF抑制骨细胞分化和基质合成；但将bFGF注入体内则不仅显著促进成骨性细胞的增生，而且增强其分化从而加速骨形成。其所以如此，是由于bFGF刺激了其它生长因子的分泌或增强其作用所致。有报道bFGF可增强成骨细胞中TGF-β的表达；bFGF在刺激骨内膜骨形成的同时增加骨内膜细胞中TGF-β的表达。可见，bFGF的作用至少部分是由TGF-β介导的。
bFGF还是强大的毛细血管增殖刺激剂，促使毛细血管向创伤区长入，为组织的修复提供营养。将重组bFGF与部分纯化的牛BMP悬液混合后注入小鼠肌肉，单独注射BMP和bFGF作为对照。21d后牛BMP/bFGF组及单纯牛BMP组均有新骨形成，但牛BMP/bFGF组钙含量是单纯牛BMP组的3倍，并有明显的血管增生现象。其所以如此，是bFGF促进了BMP诱发的需要血供的软骨内化骨。据此，应用含有血管增殖因子bFGF的骨诱导物，可能会促进某些血运不良的骨折愈合。
4. IGF
IGF-I既有局部作用，也有全身作用，对大鼠全身给予IGF-I可促进其颧弓5mm缺损之愈合；手术造成8mm全厚颅顶骨缺损，通过皮下渗压泵给予2mg IGF-I，14d后由缺损边缘长出皮质骨修复缺损，说明IGF-I可促进膜内骨缺损之修复。IGF-II是骨内含量最高的生长因子之一，其生物学作用与IGF-I大致相同。虽然IGF-II与IGF受体之亲和力较IGF-I为弱，对细胞的刺激作用也较弱，但因IGF-II在循环中之浓度较高，故可能对骨折愈合有一定作用。有报道外加磁场可刺激人成骨细胞样细胞培养和大鼠骨痂培养产生IGF-II。有用IGF-I治疗由生长激素受体缺陷引起的Laron侏儒症的报道，尚未见用于骨折治疗的临床研究。
5. PDGF
将PDGF注入小鼠颅顶骨上面可诱导新骨形成，还有促血管形成的作用。在兔胫骨截骨模型，一次注射PDGF增加了骨痂的密度和体积。组织学分析表明，截骨部位经PDGF处理后其成骨作用向前推进了一步，但生物力学测试并未显示骨强度有所提高。PDGF固然可诱导新骨形成，但因其刺激前列腺素合成而增加骨吸收，限制了其修复骨折的用途。重组PDGF可加速啮齿类伤口肉芽组织形成，临床上局部用于褥疮治疗初见成效。
综上所述，骨折修复是一个复杂的过程，需要多种生长因子的参与和协调作用，如TGF-β就是FGF的调节物之一，bFGF与IGF也表现出协同作用。在骨折不连接的治疗中，单用某一种生长因子可能效果不明显，而联合应用数种生长因子则可能会有显效，上述并用BMP与bFGF异位成骨实验中钙含量增加和明显血管增生就是明证。PDGF、IGF-I和TGF-β单用均可使离体大鼠胚胎颅顶骨之基质沉积增加，并用此诸生长因子时其刺激作用大为加强。对微型猪皮质骨缺损联合应用PDGF和IGF-I显著增加了骨痂矿化组织面积、周径及其所占百分比，优于单用PDGF或IGF-I。另据报道，联合应用BMP和PDGF或BMP和bFGF修复骨缺损，其新骨生成量及骨愈合率显著增加。此外，将生长因子与蛋白酶抑制剂合用，因其阻止生长因子的降解，当可延长其作用时间从而提高治疗效果。