复合有益茵剂对工厂化大菱鲆育苗水净化效果研究

复合有益茵剂对工厂化大菱鲆育苗水净化效果研究 
李秋芬， 张艳， 王印庚
(中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071)
关键词：有益菌；复合有益菌制剂；水质净化；大菱鲆；海水鱼类养殖
中图分类号：s 963．21 1 文献标识码：A
stuar Oil purifying efect of multi-strain probiotics product
Oil water of intensive turbot b】 Iil【lg
LI Qiu-fen，ZHANG Yan，WANG Ying-geng
(Ye／kno Sea F／sher／es Research Institute，Chinese Academy ofrisherr&ien~ ，Qingdao 205071，China)
AbsIr翻：t：On the basis of purifying efect of single-swain probiotic bacteria on water ofintensive turbot breeding，the purifying efect
ofmuld—slra．in bacteria oroduct was studied．rn results of experiments showed that the free muld—swain mixed bacteria had tletter
purifying efect on turbot breeding waterthan that ofany single-swain bacteria．this phenomenon can be explained with the principle of
“No-pump”．rn immobilized muld-slra．in probiotics product，bio-film ，also showed excellent purifying efect On wa[el"of turbot
breeding．rn removal rates of COD and ammonia in 5 days were up t0 73．1％ and 80．0％ ，respectively．rn concentration of
rlimte kept low．which indicated most ammonia had been transformed into nitrate and acclmaulation of harmful intermediate productnitrite
was decreased． TbiS pal3er supplied theoretical and technical foundadon for saving sea water through No-purification of
wltstewatel-from marine fish culture．
Key words：probiotics：probiotics product；water purification；Scophthabnus max／mus；maline fish culture
大菱鲆由于生长速度快、肉味鲜美、市场前景广阔而
成为我国近几年来备受推崇的养殖品种_l J，但随着养殖规
模扩大，养殖过程中病毒性、细菌性以及其它一些疾病开
始出现，并逐年加剧_2I4J，流水养殖方式带来的周围海域
海水污染问题El益严重，地下海水资源也El渐枯竭。随着
人们对滥用抗生素弊端的深入认识及国际上对水产品中
抗生素等化学药物残留的严格控制，减少在养殖业中使用
抗生素和化学药物的呼声越来越高。以有益菌调节养殖
水体的微生态平衡、提高水质、防治疾病、达到健康养殖目
的的生物控制理念已逐步得到认可，并已初显成效【 H9_。
有益菌在水产养殖中主要有三种使用方式：将菌液直接泼
洒入养殖池中、做成药饵投喂养殖动物或将有益菌固定化
后加入到水处理池中。细菌的固定化方法主要有包埋法、
吸附法和生物膜法等。王怡平等llo]曾用包埋法制备固定
化光合细菌；生物膜法处理废水具有产生污染少、抗冲击、
负荷能力强、运行管理方便、动力消耗少等特点，在水产养
殖用水处理上得到了广泛的应用_ll_。Lekang等_l2_曾用一
种轻质粘土复合体作为载体，使其生物膜的性能得到了改
善；王晋等_l J以经过波浪形定型处理的无纺布作为填料
制作的新型固定生物膜反应器对氨氮的去除率有了很大
的提高；山形阳一等_l J利用悬浮载体生物膜反应器去除
氨氮也取得了很好的效果。
本文从生态修复的角度人手，在分离、筛选适应大菱
鲆养殖环境、对养殖水体中的有机污染物、氨氮、亚硝酸氮
等有害物质具有去除作用的有益菌菌株的基础上，对不同
菌株进行了优化组合，制成复合菌剂，并采用游离菌和生
物膜法进行了大菱鲆育苗水体的净化试验。以期达到净
化养殖水体，使养殖用水能够循环利用、减少换水量的目
的，也为生物修复技术在海水养殖业中的推广应用提供理
论和技术依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
菌种为有机物降解菌Lt7222(Subtilus sp．)、氨氧化菌
(Nitrosanonas sp．)、亚硝化细菌Y1(Halomonas sp．)和硝
化细菌X3(Rhodococcus sp．)，由本实验室自海水养殖环境
中分离、筛选、鉴定，分别对有机污染物_1引、氨氮、亚硝酸
氮具有较强去除能力，并经安全性实验证明对养殖大菱鲆
无毒害等不良影响(另文发表)。生物膜载体为纤维滤料，
由本所宋德敬老师自行研制并提供。大菱鲆仔鱼由山东
省海阳市海珍品养殖厂提供。
1．2 实验方法
游离混合茵剂净化育苗废水 试验在2o L的玻璃
缸中进行，每个玻璃缸中加入l0 L海水，放人孵化25 d的
大菱鲆仔鱼50尾，体长1．5～2．5 cnl，体重1．0 g左右。实
验设5个组，分别为有机物降解菌、氨氧化菌、亚硝化细
菌、硝化细菌和复合菌剂，另设一个不加菌和培养基的空
白对照和一个只加无菌2216E培养基的对照。为使条件
尽可能与育苗池一致，用气石缓慢充氧，保持溶解氧都在
8．7左右，每天喂营养强化的卤虫两次，早晚各一次。温
度稳定在l5℃左右，不换水。
将平板培养基上的水质净化菌株(Lt7222、 、Y1、x3)
分别用无菌海水洗下，根据其OD600 nm值，进行适当稀
释，使菌液浓度达lo9 cells·mL 左右，每缸加入菌液50
mL，每天取样测定各缸中COD、氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮
的变化，测定方法参照海洋监测规范_1 ，NH4 一N采用次
溴酸钠氧化法，NO2一一N及NO3一一N分别用萘乙二胺分光
光度法及锌镉还原法进行测定；COD采用碱性高锰酸钾
法测定。并观察仔鱼的健康与死亡情况，及时捡出死鱼。
固定化生物膜法净化育苗废水效果试验 菌种的
初级扩大培养：将选好的菌种分别接种到液体培养基中，
于28 oC，130 r·min’1振荡培养1周，按照10％的接种量接
种到新的培养基中，重复数次次后使体积扩大到l0 L左
右。
菌种的二级扩大培养：培养基配方参照中科院微生物
研究所刘志培的配方(个人交流)：葡萄糖0．5％，碳酸钙
0．3％ ，氯化铵0．5％，蛋白胨0．03％，磷酸盐0．03％，用海
水配制，pH 8．0。将初级扩大的菌种混合，按10％的接种
量接种到配制好的二级扩大培养基中，室温2o℃左右曝
气培养(保证DO值在4 rng·L 以上)。在培养过程中，每
2天左右用显微镜观察菌的生长情况以及检测pH值，及
时用NaOH调节到8．0左右。然后可以将培养好的菌剂
作为种子进行再次的扩大培养至所需的菌种量。同时按
照培养基中各种成分的比例定期添加营养物质。
生物膜的制备：待菌种达到一定数量，开始进行生物
膜的制备。将纤维滤料悬挂于加入培养液的大约体积有
2 m3的大缸中，在培养菌种的同时进行挂膜。定期用手感
觉膜片上有无滑腻的感觉，若有则说明生物膜制备较好。
培养进行一周则挂膜基本完成。
挂膜后处理：挂膜完成后，用海水对填料进行1～2次
的浸泡，每次30 min左右，以洗掉填料上的培养液及剩余
氨氮，然后放入盛有l0 育苗池废水的生物处理系统
中，在生物膜加入到生物处理系统前测其COD及3种无
机氮的值。实验进行过程中每天取一次样，测3种无机氮
及COD的变化。测定方法同上。
2 结果
2．1 游离菌剂对育苗水体净化效果试验结果
有机物降解茵Lt7222对育苗水体的单株净化效果
因游离菌液中有残留培养基，其中含有的有机物引起试
验组初始COD值较高，同时在大菱鲆育苗过程中，由于添
加饵料及仔鱼的代谢，水体中的有机物会逐渐积累，未加
菌空白对照组的COD值均呈逐渐上升趋势。5 d后即由
2．78 rng·L’1升至9．05 rng·L-1增长率为22．5％。而加菌
组COD值则呈逐渐下降趋势，5 d后，从初始的l2．73 rng·
L 降至4．77 nag·L一，COD去除率达60．8％ (图1)。由
此说明，有机物降解菌Lt7222对大菱鲆育苗水体的有机
污染物有较明显的去除作用。
l8
l6
l4
l2
l0
8
6
4
2
0
时间time／d
图1 有机物降解菌Lt7222对大菱鲆
育苗水体的净化效果
F ．1 Pur~Ang efect of c pollutant-degrading
bacteria Lt7222 Oil rearing water of nlrb0t
氨氧化茵A3的单株净化效果 如图2所示，育苗
试验期间，加氨氧化菌 实验组的氨氮浓度由0．34 rng·
L’1降到0．21 rag·L～，最高的降解率为44．1％，未加菌对
照组的氨氮浓度由0．328 rng·L’1上升为0．343 rng·L一，
两者有显著性差异(P值为0．O48)；实验组的亚硝酸氮浓
度由0．012 rng·L’1上升到0．027 rng·L～，空白对照组由
0．012 rag·L 上升到0．019 rag·L一，都有上升的趋势，但
实验组上升幅度较大，两者有显著性差异(P值为0．027)。
一T-1．旨一＼IqlⅡ0u
实验组的硝酸氮浓度由0．50 Illg·L一 降到0．38 Illg·L～，
空白对照的由0．48 ll1g·L-1降到0．41 mg·L～，分析得知，
二者无显著性差异(P值为0．72)。由此可见，氨氧化菌
A3对育苗水体中的氨氮有一定消除作用。
n
— o--删3一N对照control + NH3
+ _N对照control 十N02一N
O 1 2 3 4 5 6
时间time／d
图2 氨氧化菌A3对大菱鲆育苗水体的净化效果
F ．2 Purifying efec~of Amonia-oxjdiTing bacteria A3
Oil rearingwaterofnⅡb0t
亚硝化茵Y1的单株净化效果 由图3可见，育苗
实验过程中，加入亚硝化菌Y，的实验组和未加菌对照组
的氨氮浓度均有上升趋势，但对照组有较大的上升幅度，
由0．12 mg·L-1升到0．44 mg·L～，实验组由0．14 mg·L-1
升到0．24 mg·L～；对照组与实验组的亚硝酸氮浓度都有
一定的上升，实验组升高的幅度要大于对照组，但两者之
间无明显差异(P值为0．074)；对照组的硝酸氮浓度总体
呈下降趋势，由0．89 mg·L-1降到0．65 mg·L-1；实验组的
硝酸氮开始时略微下降，随后的时间略有升高，基本保持
稳定，第6天时由初始的0．73 ITlg·LI1变为0．79 Illg·L～，
两者之间无明显差异(P值为0．5613)。
1．
n
譬n
璐8&
图3 亚硝化细菌Y。对大菱鲆育苗水体的净化效果
Hg．3 Purifying efect of nitrificaling bacm~ Y1
on rearingwaterofnⅡb0t
硝化细茵x3的单株净化效果 可能由于菌液培养
基残留的亚硝酸氮可转化为氨氮，加菌实验组的初始氨氮
浓度就高于对照。育苗过程中实验组和对照组的氨氮浓
度均有所上升，由初始时的0．12 mg·LI1升到0．34 mg·
L～，由此可见，硝化细菌对氨氮的利用率很低，单纯加入
这一种细菌对水体中的氨氮的去除效果不佳。
同样原因，加菌组的初始亚硝酸氮浓度也高于空白对
照组，育苗过程中，加入硝化菌的实验组亚硝酸氮的浓度
由初始的由0．168 mg·L-1降到0．143 mg·L一1 o则对照组
则由0．009 mg·L-1升到0．029 mg·L～，两者相比，P值小
于0．05，有显著性差异。空白对照组中的硝酸盐氮浓度由
初始的0．89 Illg·L-1变为0．75 Illg·L～，趋势是下降、上
升，又下降，实验菌组的则逐渐上升，由0．83 mg·L-1升为
0．94 mg·L～，说明硝化细菌可有效地将水体中的亚硝酸
盐转化为硝酸盐。
— 删3一N 对照control + NIt3一N
+ N02一N 对照control + N02一N
L0
一a n9
蠢 童鐾2
爱8黯
0
0 1 2 3 4 5 6
时间time／d
图4 硝化细菌 对大菱鲆育苗水体的净化效果
Fig．4 Purifying efect of nitrificafing bacteria x3
Oil rearing water of nⅡb0t
复合茵剂对大菱鲆育苗水体的净化效果 复合菌
剂对大菱鲆育苗水体的净化效果如图5所示，加菌实验组
的COD值呈明显下降趋势，5 d后由初始的8．65 Illg·LI1
降到3．05 mg·L～，降解率可达64．4％；而对照组则由3．
78 mg·LI1升至8．05 mg·LI1(图5一a)。由此可见，复合菌
剂对大菱鲆育苗废水中有机物的降解效果优于单株菌。
加复合菌组的育苗水体中的氨氮浓度迅速由初始的0．37
nag。L-1降为0．14 rag·L～，后面几天一直维持在较低的水
平，总去除率为67．3％，均高于单株的氨氧化菌、亚硝化细
菌和硝化细菌。由于鱼类的代谢，对照组水体中的氨氮浓
度则不断升高；实验组和对照组的亚硝酸氮浓度均始终保
持在较低水平，略有升高，由0．016 mg·L 增到0．052 mg·
L～；不同的是加菌组的硝酸氮浓度呈不断升高趋势。由
初始的0．360 Illg·LI1增到0．390 Ing·L～，趋势由下降到
上升，而对照组则呈下降趋势(图5_b)。由此说明，游离复
合菌剂对大菱鲆育苗水体有明显的净化效果，且优于单株
菌的效果，且在不换水的情况下，可长时间维持良好水质。
2．2 固定化复合菌生物膜法对育苗废水的净化
效果
经过2周多的培养，得到了驯化成熟的生物膜片。如
图6-a所示，加入固定化复合菌膜的养殖废水的CO D呈逐
渐下降趋势，5 d后由初始的5．82．nag·L 降到1．57 mg．
L～，降解率可达73．1％；而对照组则由3．72 mg·L-1降至
3．05 mg·LI1(图6-a)。由此可见，加入固定化的复合菌剂
所引起的原水体COD升高值低于游离复合菌剂，对大菱
鲆育苗废水中有机物的降解效果优于单株菌和游离复合
菌。
大菱鲆育苗废水加入固定化复合菌膜后，氨氮浓度由
初始的0．300 mg·L一 降为0．O6O mg·L_。，去除率为80％；
目
凸
0
3 讨论
亚硝酸氮浓度始终保持在较低状态，略有升高，由0．016
mg-L一 增到0．052 mg·L-1；硝酸氮由初始的0．36O mg’
L一 增到0．390 mg·L_。，趋势由下降到上升，而对照组则
呈下降趋势(图6-b)。
— —N}I3-N 对照control
— —
NO2-—-一NH3—N mix bacteria
— ★一N02—N mix bacteria
0 1 2 3 4 5 6 0
时间time／d
2 4 6
时间time／d
图5 游离复合活菌制剂对大菱鲆育苗废水的净化效果
Fig．5 Purifying efect ofnfix bacteria Oil wastewater from nlIb0t reanng
t —_c N}I3-N对照control + N}I3-N mix bacteria
十NO2-N对照control + N02-N mix bacteria
图6 固定化复合活菌制剂对大菱鲆育苗废水的净化效果
Fig．6 Purifying efect of hranobilized nfix bacteria Oil wastewamr from nlIb0t reanng
从实验结果可看出，使用有益菌复合菌剂对大菱鲆养
殖废水的净化效果明显好于单独使用某一种有益菌的效
果，复合菌的COD去除率为68．4％ ～73．1％ ，高于单株菌
LI7222的60．8％，氨氮的降解率为80％，高于 的25．3％
和Yl的77．4％，且有害中间产物亚硝酸氮始终维持在较
低水平。其机理可能是因为所选菌株中，有机物降解菌在
酶的催化下，将有机氮分解为氨氮，氨氧化菌和亚硝化细
菌再将氨氮转化为亚硝酸氮，而硝化细菌则以亚硝酸氮为
底物产生硝酸盐，这样就构成了一个生化反应链。当一种
菌不断以另一种菌的生化反应产物作为其生化反应的底
物，就会拉动前一种反应的进行，而前一种反应产物的积
累又加快了后续反应的速度，因而，整个反应链的速度得
以提高，使整个反应更加彻底。有机污染物降解也就更彻
底。因此，在选择有益菌净化水质时，菌株问的合理搭配、
优化组合是成功的关键所在，这一观点已为广大学者认
可【¨，璩』。在试验中发现，硝化细菌生长比较缓慢，试验后
期，水中的亚硝酸氮有所上升，可见使用复合菌剂净化水
质时，亚硝酸氮向硝酸氮的转化是整个反应中的限制因
素。因此，在制备或使用复合菌剂时应注意使各种细菌保
持合适的比例，并通过筛选或驯化性能优良的硝化细菌菌
株或改善其生长条件，来加强亚硝酸盐向硝酸盐转化的效
率。
由实验结果还可看出，将复合菌固定化制成生物膜对
养殖废水的净化效果优于游离复合菌剂。生物膜一方面
避免了将培养基的成分带入养殖水体，增加水体的污染程
度，另一方面也避免了由于菌体直接加入到养殖水体随水
∞们 ¨∞ 叭o
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流失造成的损失，而且不受养殖池施加药物等操作的影
响。王怡平等[1oJ曾用包埋法制备固定化光合细菌，具有
使用方便、易保存等优点，但是文中也提到目前尚存在成
球难、易发胀粘连及包埋细胞活性下降等问题。我们在研
究中发现以海藻酸钙为载体的固定化菌体凝胶珠在淡水
中可保持较长时间的稳定性，在盐度较高海水中稳定性很
差，短期内即出现解体[19J，本实验中将菌液固定于本所科
研人员自行研制的纤维滤料上，制成生物膜片，具有比表
面积大、透气性好、细菌活性不受影响、使用寿命较长等优
点，并且生物膜由于固着在滤料或载体上，因此能在其中
生长世代时间较长的细菌和较高级的微生物，如硝化细菌
的繁殖速度要比一般的假单胞菌慢40～50倍，这就使生
物膜法在去除有机物的同时具有脱氮除磷的作用，尤其是
对受有机物及氨氮污染的河流有明显的净化效果[20J。
此生物膜的缺点是挂膜需要一定时间、需定期补充营
养物质、易受温度等环境因素的影响，浸水后滤料的体积
和重量较大，更换和转移困难，只能适用于养殖废水的集
中处理，为节约成本和使用方便，今后须进一步研究可直
接用于养成池和育苗池的固定化方法。
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