色谱指纹图谱分析技术用于鉴别中药玄参产地的研究

【摘要】  目的采用高效液相色谱（HPLC）色谱指纹图谱分析技术鉴别中药玄参产地。方法采用HPLC法测定了重庆市武隆县玄参等14个不同产地玄参样品。色谱条件C18柱，甲醇-1%冰醋酸为流动相进行梯度洗脱，检测波长290 nm，体积流量1.0 ml/min，柱温30℃。结果对重庆市武隆县10批次玄参样品的多个活性成分进行综合评价，筛选出重庆市道地药材玄参为建模对象，合成出玄参的标准HPLC色谱指纹图谱模型；并用此模型和特征成分的相对峰面积比值准确地区分浙江省磐安县等不同产地玄参。结论研究将有助于玄参药材的标准化种植及质量控制。

【关键词】  玄参 肉桂酸 高效液相色谱法 指纹图谱 质量控制

　　Identification of the Habitat of Radix Scrophulariae with Chromatographic Fingerprinting

    MA Dengfeng1，ZHOU Nong2,BAI Zhichuan1*,FANG Lijing1,SUN Chanjuan1

    （1.Horticulture Garden Institute of Southwest University ,Chongqing 400715,China； 2.Pharmacological College, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China）

    Abstract：ObjectiveTo identify the Habital of Radix Scrophulariae with Chromatographic Fingerprinting.MethodsActive constituents were extracted from ten batches of sample of Radix Scrophulariae (Scrophularia ningpoensis Hemsl.), which collected from Chongqing Wulong county, and evaluated by HPLC. Chromatographic conditions was Kromasil TM C18 column with methanol-1% glacial acetic acid as mobile phase, the detection wavelength was 290 nm, the flow rate was 1.0 ml·min-1, and column temperature was 30℃.ResultsMany active constituents that extracted from ten batches of sample of Radix Scrophulariae (Scrophularia ningpoensis Hemsl.), which collected from Chongqing Wulong county, were evaluated by HPLC. The models of standard HPLC Fingerprint of Radix Scrophulariae were established; Taking the cinnamic acid as the reference peak, the relative time and the relative peak area ration of various characteristics peak were calculated, and the sample from Zhejiang province could be distinguished by this model and the relative peak area ratio of the characteristic components.ConclusionThis study is good for the standard planting and quality control of Radix scrophulariae.

    Key words：Radix Scrophulariae（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）;   Cinnamic acid；  HPLC；  Fingerprint；  Quality control

    玄参科植物玄参Scrophularia  ningpoensis  Hemsl. 的干燥根具有凉血滋阴、泻火解毒的功效，临床上用于治疗热病伤阴，舌绛烦渴，温毒发斑，津伤便秘，骨蒸劳嗽，目赤，咽痛，瘰疬，白喉，痈肿疮毒［1］。玄参含哈巴苷、哈巴苷元、桃叶珊瑚苷、6-对甲基梓醇、浙玄参苷甲、乙等环烯醚萜类化合物及生物碱、植物甾醇、油酸、硬脂酸、葡萄糖、天冬酰胺、微量挥发油等［2］。《中国药典》2005年版Ⅰ部对玄参的质量控制采用HPLC法测定其中哈巴俄苷的含量［1］。众所周知，单一指标性成分的含量测定往往难以反映中药整体质量，而指纹图谱具有系统性、特征性和重现性特点，能较全面反映中药品质，现已成为中药质量评价和控制研究的热点之一［3～5］。本文以具有轻泻、抗细菌及真菌等作用的肉桂酸 ［6］作为指标成分，采用HPLC法构建不同产地玄参药材的指纹特征谱，为追踪不同产地的生药来源、保证中成药的质量可控、建立可行的质量控制方法奠定了基础。

    1  器材与方法

    1.1    仪器Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996 DAD二极管阵列检测器，Empower色谱工作站；METTLER AE240天秤（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SENCO，W2018型恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）；SENCO，R系列旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；SHB-3型循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；微型植物试样粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）。

    1.2    试剂甲醇为色谱醇（美国Fisher试剂公司），水为二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

    1.3    药材肉桂酸对照品（供鉴别用，批号0786-9802）由中国药品生物制品检定所提供。不同产地玄参药材样品来源（见表1），经西南大学园艺园林学院植物学教研室白志川教授鉴定为玄参科植物玄参Scrophularia  ningpoensis  Hemsl. 的干燥根。表1  玄参样品来源（2005年）

    1.4    色谱条件色谱柱为YPW-Kromasil TM C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）（美国迪马公司）；流动相：甲醇-1%冰醋酸，流动相A为甲醇，流动相B为1%冰醋酸水溶液。检测波长290 nm，柱温30 ℃，流速1.0  ml/min，进样量20 μl。理论塔板数按肉桂酸峰计算不低于2 000，与其它峰的分离度均大于1.0，所有组分均在50 min内被检测完。见表2。表2  指纹图谱流动相线性梯度表

    1.5    对照品溶液的制备精密称取肉桂酸对照品适量，加甲醇制成每毫升含50.0 μg的溶液，即得。

    1.6    供试品溶液的制备取玄参药材粉末（过50目筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 ml，密塞，称定重量，浸泡1 h后，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

    1.7    方法学考察

    1.7.1    稳定性实验取同一批次供试品（样品号：8），在室温下放置，分别于0，2，4，6，8，10，12，24，36，48 h检测指纹图谱。用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果表明，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度分别为0.999 7，0.999 8，0.999 5，0.999 7，0.999 6，满足相似度不小于0.950的要求，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.00%～0.28%和0.00%～2.95%，RSD＜3.00%，各色谱峰的相对保留时间在平均保留时间±1 min内，符合指纹图谱要求。说明供试品溶液的成分在48 h内是稳定的。

    1.7.2    精密度实验取同一批次供试品（样品号：8），连续进样5次，记录指纹图谱。用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果表明，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度分别为0.999 2，0.999 8，0.999 6，0.999 7，0.999 8，满足相似度不小于0.950的要求，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.00%～0.34%和0.00%～2.85%，RSD＜3.00%，各色谱峰的相对保留时间在平均保留时间±1 min内，符合指纹图谱要求。说明仪器的精密度良好。

    1.7.3  重复性实验取同一批次样品（样品号：3），按供试品溶液的制备方法分别制备5份供试品，记录指纹图谱。用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果表明，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度分别为0.999 9，0.999 2，0.999 6，0.999 8，0.999 3，满足相似度不小于0.950的要求，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.00%～0.34%和0.00%～2.84%，RSD＜3.00%，各色谱峰的相对保留时间在平均保留时间±1 min内，符合指纹图谱要求。说明该实验方法的重复性较好。

    2   结果

    2.1    供试品测定同一上述实验条件下，连续测定14批次供试品HPLC色谱图。

    2.2    指纹图谱根据重庆市武隆县10批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（相对保留时间）等相关参数，进行分析、比较，制定优化的指纹图谱见图1。

    2.3   指纹图谱分析与评价用“1.4”项下的色谱条件测定了重庆市武隆县10批次玄参药材指纹图谱，见图2。通过对重庆市武隆县等10个产地药材指纹图谱的测定结果，比较其色谱图，确定了14个色谱峰为各产地药材的共有峰。对各指纹图谱中的共有峰的保留时间和相对保留时间进行统计，计算结果见表3。表3  玄参药材14个共有特征峰的保留时间和峰面积

    2.3.1  共有指纹峰标定  根据10批次供试品测定结果，标定共有指纹峰。玄参HPLC指纹图谱中，共有指纹峰14个。与肉桂酸参照物峰（12号峰）相比，其他13个共有指纹峰相对保留时间如表4所示，共有指纹峰相对峰面积如表5所示。

    结果表明，各产地药材中共有峰的相对保留时间非常相近，RSD在0.00%～1.42%之间，这也进一步证实了各共有峰选择的准确性。表4  玄参药材HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间表5  玄参药材HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积结果表明，重庆市武隆县不同批次的玄参药材HPLC指纹图谱存在一定的差异，其共有峰相对保留时间基本一致，相对峰面积比值存在较大的差异，其原因有待进一步探索。

    2.3.2  共有指纹峰面积比值  根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》规定，各共有指纹峰的峰面积的比值必须相对固定：单峰面积占总峰面积≥20%，其差值＜20%；单峰面积占总峰面积≥10%而＜20%，其差值＜25%；单峰面积占总峰面积＜10%，面积比值不做要求，仅需检定相对保留时间。结果表明，除肉桂酸参照物峰（12号峰）以外，1号、6号、11号共有指纹峰面积（峰）超过总峰面积的10%而小于20%，规定1号峰相对峰面积比值为0.331 5～0.552 5，规定6号峰相对峰面积比值为0.477 6～0.796 0，规定11号峰相对峰面积比值为0.559 5～0.933 1。

    2.3.3  共有指纹峰特征  1号峰后分裂有1个小峰，2号峰与3号峰之间有3～5个小峰；3号峰与4号峰之间有一段锯齿状峰；4号峰为一平头峰，4号、5号、6号、7号和8号为相连峰，其中5号峰为连在一起的小锯齿峰；8号和9号峰之间有1小峰；9号与10号峰之间有一段锯齿状峰；11号与12号峰（S峰）之间有一个小峰；12号和13号峰（保留时间为25.857～38.407 min）之间为平滑直线；13号与14号峰为相连峰，其中14号峰之后有一个小峰相连。

    2.3.4  相似度评价  采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版对重庆市武隆县等地10批次玄参药材的指纹图谱进行相似度的分析。以相关系数（中位数）代表其相似度，与玄参药材的对照指纹图谱（共有模式）比较，10批玄参药材的相似度见表6。表6  与玄参药材HPLC指纹图谱共有模式比较的玄参样品的相似度评价

    结果表明，重庆市武隆县等地10批次玄参药材样品的相似度为0.915～0.975之间，均大于0.900，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》规定。

    2.4  不同产地玄参药材的HPLC指纹图谱鉴别在研究建立了比较稳定的玄参药材HPLC指纹图谱分析测试方法的基础上，我们对重庆市南川市、浙江省磐安县、湖北省巴东县、贵州省道真县等4个不同产地的玄参药材进行了HPLC指纹图谱的鉴别：分别精密称取其干燥至恒重的药材粉末（过3号筛）4份，每份1 g，按“1.6”方法制备供试品溶液，按“1.4”色谱条件进行测定，记录其HPLC色谱图。

    采用国家药典会员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版对浙江省磐安县等地4个不同产地玄参药材的指纹图谱进行相似度的分析。以相关系数（中位数）代表其相似度，与玄参药材的对照指纹图谱（共有模式）比较，结果见表7及图3。表7  不同产地玄参药材供试品与玄参药材共有模式相似度比较

    结果表明，4个不同产地的玄参药材的指纹图谱与重庆市武隆县的玄参药材共有模式差别较大，共有指纹峰仅有6个，相似度均小于0.800。玄参甲醇提取物的HPLC指纹图谱共有模式所得色谱图中的14个共有色谱峰可作为其指纹特征，用于鉴别玄参药材的多个产地。

    3  讨论

    3.1   供试品溶液制备条件的考察  试验比较了不同提取溶剂如石油醚、氯仿、丙酮、乙醇、甲醇的水浴回流和索氏提取、超声提取等不同提取方法的提取效果，结果以甲醇超声提取的总体效果为佳。同时还考察了以甲醇为提取溶剂，不同提取时间（20，30，40 min）的提取效果。结果表明，以甲醇为提取溶剂， 超声提取30 min，提取较完全，操作方法简便，且方法稳定、重现性好。采用甲醇超声提取样品，所得图谱信息量较大，既含脂溶性成分也包括水溶性成分，符合指纹图谱整体性的要求，其尽可能反映了药材所含的全部信息，可以作为综合质量评价的方法。

    3.2   色谱条件的选择及优化  在流动相系统的选择中，分别以甲醇-水、甲醇-1%冰醋酸、乙腈-水、乙腈-1%冰醋酸等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行了等度和梯度洗脱试验。结果表明，用甲醇-1%冰醋酸进行梯度洗脱为佳，色谱峰检测比较全面，锋形尖锐且分离度较好，峰面积较大，调整流动相不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于指纹图谱的分析。

    3.3   检测波长的选择  对190～400nm 扫描的各波长下的色谱图进行比较分析，结果290 nm 处检测的色谱图不仅基线平稳，信息量多，各色谱峰的分离效果很好，峰面积大，而且参照物肉桂酸在此波长下有较大吸收。因此，选290nm 作为检测波长。同时按照试行标准的要求考察了其他波长下的色谱图，其结果显示重庆市武隆县等地10批次玄参样品在不同波长下的色谱指纹图谱具有很好的相似度。

    3.4   分析时间的选择  在选择指纹图谱的洗脱时间时记录了2 h的色谱行为图。结果表明40 min以后基本没有色谱峰出现，同时为了照顾样品的产地、采收时间、加工方法等的差异性，保证所有样品的特征峰都能够被检出，因此选择50 min作为分析时间。

    本论文所研究的重庆市武隆县的玄参药材HPLC指纹图谱具有比较好的稳定性和重复性，10批玄参样品指纹图谱的特征性和专属性很强，其主要峰群的整体图貌基本一致，14个共有峰的稳定性很好，建立的重庆市道地药材玄参的HPLC指纹图谱，符合国家药品监督管理局颁发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》和《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南》的要求。

    在玄参指纹图谱研究中，主要以玄参中的活性组分肉桂酸作为指纹图谱研究的重点，从重庆市武隆县产10批次玄参药材的特征指纹峰图谱都能找到了14个共有峰相对保留时间符合程度较好，其含量均大于90%。但相对峰面积相差较大，说明玄参用药应在固定产地的前提下，才能保证药品的一致性，因此建议有条件的制药企业，可采用浸膏来控制生产工艺，保证药品的质量。

    通过对重庆市武隆县玄参样品的多个活性成分进行综合评价，筛选出重庆道地药材玄参为建模对象，合成出玄参的标准指纹图谱模型；以肉桂酸为参考峰，计算各特征成分相对时间比和相对峰面积比。用此模型和特征成分的相对峰面积比准确的区分不同产地玄参。玄参指纹图谱的建立不仅为中药材玄参的质量控制提供了方法，而且采用指纹图谱来评价玄参药材质量，为玄参进一步深入研究开发，奠定了基础，具有重要意义。通过该研究为有效控制玄参药材的质量提供了新的手段。

    玄参药材作为一味常用中药，由于其具有很强的生长适应性，故在我国大部分地区特别是浙江、重庆等地区都有广泛的种植，带来的问题是药材种质不清、质量不稳定、成分稳定性差，药材质量的可追溯性差等诸多问题，使得“质”和“量”均无法保证。要控制玄参药材的质量，传统的依靠单一组分评价药材质量的做法已经无法适应当前的需要，而指纹图谱的方法可以系统的、特征的、稳定的综合评价药材的质量，符合整体质量控制的要求，为国际上所认可，将促进中药现代化、国际化的快速发展。

    致谢：西南民族大学少数民族药物研究所刘圆副教授和彭镰心硕士在玄参样品处理过程中提供帮助。

【参考文献】
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