小鼠视网膜新生血管模型的建立及特征02

http://www.cnophol.com 2009-8-27 11:25:09 中华眼科在线
我们将生后第7d的C57BL/6J小鼠暴露在75%的氧浓度环境中，5d后返回正常空气，使得视网膜相对缺氧，以最大程度刺激并增加功能异常且渗漏的新生血管产生。若选择刚出生的小鼠置于高氧环境中，玻璃体动脉的异常扩张伴视乳头新生血管会使模型新生血管的量化困难并且重复性减低。而C57BL小鼠生后第7d小鼠的玻璃体腔内血管基本退行，视网膜血管发育尚未成熟，因此当缺氧刺激后所出现的血管增生性反应主要为异常的视网膜血管增生，这样可以最大限度地反应出病理情况下视网膜血管新生的程度，减少检测视网膜血管增生时的误差，所以选择C57BL小鼠生后第7d是进入高氧环境进行实验的最佳时间。
图1  小鼠荧光素灌注造影、视网膜铺片结果（略）
A：正常组小鼠视网膜（×4）；B：模型组小鼠视网膜，箭头代表无灌注区（×4）；C：血管迂曲、扩张（×20）；D：荧光渗漏（×20）
图2  小鼠视网膜切片HE染色结果（×40）（略）
A：正常组小鼠视网膜；B模型组小鼠视网膜，箭头所指的即为突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核
动物模型制备过程中，母鼠能否存活是关系到新生小鼠能否健康成长的关键因素，是人工喂养难以替代的，母鼠的死亡可间接导致动物模型制备的失败。在实验中我们发现，母鼠的耐高氧能力显著比新生鼠弱，不能连续在高氧环境中存活5d。所以我们选择母鼠交替的方法，在每日定时打开氧舱清扫换食时，将正常环境中的哺乳母鼠与舱内母鼠更替，这样母鼠能在整个实验过程中存活下来。同时，氧舱内的氧浓度也需保持稳定，过低的氧浓度对新生血管的形成不利，会影响成模，而>80％的氧浓度虽然会一定程度上增加小鼠视网膜新生血管的生成，但同时会使小鼠及母鼠的死亡率明显上升，因此实验采用了75%±2%的氧浓度，使实验小鼠产生基本一致的血管增生性反应。我们安排了专业人员每天平均1～2h观测一次氧浓度，如果有变化及时予以调整。另外，应注意让实验小鼠和哺乳母鼠生活在一个相对固定的地方，饲养室内应保持安静，避免嘈杂；安排专业人员饲养，不宜经常更换；每天定时换水、换食、换敷料，保证母鼠正常的饮食和保证生活环境的干燥舒适，避免母鼠受到环境的不利影响和外界刺激造成母鼠吞食小鼠的情况，保证了同一实验条件下的动物数量。在实验中，我们还发现氧诱导的模型组小鼠比正常组小鼠体型小、质量轻，说明小鼠在高氧环境中有发育延缓的趋势。
新生小鼠离开高氧环境进入相对低氧环境后，视网膜逐步产生新生血管，至生后第17d视网膜新生血管的生长达到高峰[78]，之后新生血管逐渐被正常的血管分支方式所取代，所以我们选择在小鼠生后第17d进行形态学观察新生血管生成情况。由于小鼠眼球较小，直接进行眼底观察非常困难，采用离体视网膜铺片则可以帮助我们客观完整形象地观察小鼠视网膜血管形态和分布情况。采用墨汁染色和ADP酶染色方法存在染色背景过高、显影不清、视网膜染色不完全、显影不稳定、操作复杂等缺点。另外实验初期我们应用临床所用的造影剂荧光素钠进行实验观察，由于该化合物分子量低，在行视网膜固定铺片过程中已有大量渗透过血管壁，使整个视网膜组织呈现弥散的绿色荧光，不能清楚显示出正常和异常血管，且重复性差。而相对高分子量的荧光素因渗透异常血管壁的速度慢，在完成造影及随后的视网膜固定铺片时可清晰地显示出正常和异常视网膜血管完整的走行、形态。在氧诱导的模型小鼠视网膜上可观察到视网膜中央大量的无灌注区域，由于高氧使得视网膜正常血管发育被抑制，从而形成无血管区域。而高氧后相对的缺氧环境使新生血管大量产生，由于新生血管形态异常，缺乏正常的血管屏障特性；本研究通过应用高分子质量的荧光素灌注后所获得的视网膜铺片可以清晰地分辨出缺氧和高压状态下所致的一系列典型的病理改变，如血管呈高度扭曲、扩张，高荧光渗漏区等特征表现[9]。
另外，我们还对模型眼的眼球进行了连续切片，观测突破内界膜的血管内皮细胞核数，以客观评价该模型新生血管生成情况。视网膜内界膜在正常情况下均匀一致而无特殊结构及细胞，视网膜血管位于内界膜下，不会突破内界膜。而病理状态下的新生血管会突破内界膜位于视网膜表面。因此，一般将突出于视网膜内界膜进入玻璃体腔的血管视为是视网膜新生血管。目前国内外都以计数视网膜组织切片中突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数作为进行定量研究的标准[10,11]。苏木素—伊红染色可很好地显示视网膜内界膜及突破内界膜的血管内皮细胞核，且方法简便易行，通过计数视网膜组织切片中突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数可反映视网膜新生血管的增生情况。正常组小鼠突入内界膜的血管内皮细胞核数非常少，为0.38±0.21个/片/眼，而模型组小鼠有大量血管内皮细胞核突破内界膜，为48.65±6.24个/片/眼，差异具有显著统计学意义（P<0.01）。
本实验选择的氧诱导视网膜缺血小鼠模型具有制作方法简便、重复性好、制作周期短、动物来源方便、价格低廉等优点，可作为理想的视网膜新生血管模型。另外实验中还发现在氧诱导的新生血管模型中，左右眼视网膜新生血管的严重程度具有较好的一致性[12]，这方便我们在观察研究中可把一眼作为实验观察对照组，另一眼作为实验组，客观对比反应出目的研究的效果。
【参考文献】
1 Zhang H, Sonoda KH, Qiao H, et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Jpn J Ophthalmol 2007;51(4):251257
2 Matsuoka M, Ogata N, Minamino K, et al. Leukostasis and pigment epitheliumderived factor in rat models of diabetic retinopathy. Mol Vis 2007;29(13):10581065
3 Ohnomatsui K, Hirose A, Yamamoto S, et al. Inducible expression of vascular endothelial growth factor in adult mice causes severe proliferative retinopathy and retinal detachment. Am J Ophthalmol 2002;160(2):711719
4 Saito Y, HasebeTakenaka Y, Ueda T, et al. Effects of green tea fractions on oxygeninduced retinal neovascularization in the neonatal rat. J Clin Biochem Nutr 2007;41(1):4349
5 Mookadam M, Leske DA, Fautsch MP, et al. Antithyroid methimazole in an acidosisinduced retinopathy rat model of retinopathy of prematurity. Mol Vis 2005;2(11):909915
6 Barkana Y, Gerber Y, Elbaz U, et al. Central corneal thickness measurement with the Pentacam Scheimpflug system, optical lowcoherence reflectometry pachymeter, and ultrasound pachymetry. J Cataract Refract Surg 2005;31(9):17291735
7 Gu X, Samuel S, ElShabrawey M, et al. Effects of sustained hypemxia on revascularization in experimental retinopathy of prematurity. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002;43(2):496502
8 Leske DA, Wu J, Fautseh MP, et al. The role of VEGF and IGF1 in a hypercarbic oxygeninduced retinopathy rat model of ROP. Mol Vis 2004;21(10):4350
9 Caporossi A, Casprini F, Tosi GM, et al. Preliminary results of cataract extraction with implanmtion of a singlepiece AcrySof intraocular lens. J Cataract Refract Surg 2002;28(4):652655
10赵勇,任兵,高晓唯,等.TNP470治疗高氧诱导幼鼠视网膜病变的作用.国际眼科杂志 2007;7(4):965968
11 Zhang S, Leske DA, Holmes JM. Neovaseularization grading methods in a rat model of retinopathy of prematurlty. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;41(3):887891
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