第六章 芋种质资源遗传多样性分子评价

第六章 芋种质资源遗传多样性分子评价

摘要 本研究在广泛收集国内外150多份芋种质资源的基础上，选择了49份有代表性的材料，进行RAPD分析，从DNA分子水平上反映了芋种质资源丰富的遗传多样性，同时也筛选出一批对芋属植物进行研究较为适宜的RAPD随机引物序列及优化的PCR程序。利用RAPD聚类分析技术不仅可验证芋种下已确定的亲缘关系，对尚未确定其分类地位和来源不明的资源材料的归属问题也可提供分子水平的证据。两份花茎用芋被聚到了一起，与叶用芋类的亲缘关系较近；湖南著名的江永香芋、祁阳香芋不仅来源地接近，植物学性状相似，遗传距离（1.0）也很近，可认为是同一品种的不同名称；历史悠久的山东莱阳芋遗传距离介于紫芋类和绿白多子芋类之间，可能是来源于南方的多子芋，由于数百年来长期栽培在较干旱的生态环境中，产生了一定的遗传变异，形成了独具特色的北方旱芋类型；还需要有更多的证据和多学科的进一步论证。应用RAPD分子评价结合芋的部分植物学性状等背景资料，有助于芋的种下分类系统的补充和调整，并能给予一定合理的解释。

关键词：芋；种质资源；遗传多样性；RAPD；分子评价

芋为天南星科多年生宿根性草本植物，作为一种以无性繁殖为主的作物，芋在世界各国的研究相对较少，特别是在种质资源、进化与分类等方面。我国具有丰富的芋种质资源〔1〕，在南方各省区均有野生种和栽培种；尤其是在位于西南地区的云南省，那里不仅是植物资源的宝库，而且是芋资源的重要分布区〔2〕；北方亦有栽培〔3〕。DNA分子水平上的遗传多样性研究有助于阐明作物的起源和演化关系，进行科学的分类以及制定作物种质资源收集、保存方案等。RAPD分析是建立在PCR技术基础上的一种分子标记技术，可直接反映染色体组DNA多态性。它具有操作简便、迅速，不受取样环境、时间、器官限制且准确性高等优点，被广泛用于多种植物种属资源的鉴定和分类〔4〕。云南红芋（开花芋）在分类上分歧最大。杨保国（1994）[5]，张东晓（1998）[6]认为其属于紫芋种；张志（1984）依据食用部分把芋分为叶用芋和球茎用芋两个变种[7]，蔡克华（1995）[8]提出：“如在张志的分类法中再增加一个花芋变种似更全面”。普迎冬等（1999）[2]“根据蔡克华和魏文麟的观点，将调查的芋分为叶用芋变种、茎用芋变种和花用芋变种三大类”。但未见有说服力的证据。本研究在广泛收集150多份芋种质资源的基础上，选择了49份有代表性的材料，利用RAPD分子标记技术分析其遗传多样性，试图对不同植物学性状的芋材料的演化关系、云南红芋和其它特殊类群的分类地位提供分子评价的依据。

1 材科与方法

1．1  材料

该实验所用的49份芋材料（见表6-1），部分取自武汉国家种质水生蔬菜芋资源圃，其余部分为芋资源调查收集的材料。

 表6-1  49份供试芋材料的植物学性状

Table 6-1  The botanic characters of 49 taro materials

样品编号

Sample No

芋头名称

Local name

采集地点

Place of

origin

品种类型

Type

叶心

Color

Of middle

Of leaf

叶缘

Color

Of leaf

edge

叶柄下部

Color

Of lower

Part of

petiole

叶柄上部

Color

Of upper

 Part

of

petiole

结合处

Color

Of link

Of leaf

And petiole

1

X₁

湖南长沙

多子芋

紫色

绿色

绿色

绿色

淡红

2

莱阳孤芋

山东莱阳

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿白

3

X₂

湖南长沙

多子芋

绿白

绿色

绿色

绿白

绿白

4

莱阳分芋

山东莱阳

多子芋

紫色

绿色

绿色

绿色

绿色

5

X₃

湖南长沙

魁芋

紫色

绿白

绿色黑鞘

绿色

淡红

6

X₄

湖南长沙

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿白

7

莱阳花芋

山东莱阳

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿色

8

广东多子芋

广东省

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿白

9

溧阳红芽芋

江苏省

多子芋

红色

紫色

乌绿色

乌绿色

绿白

10

古夫芋

湖北省

花用芋

紫红

水红

绿带水红

水红

红色

11

沙市糯芋

湖北省

多子芋

绿白

绿白

绿白

绿色

绿色

12

广华多头芋

湖北省

多头芋

红色

紫色

淡乌绿色

乌绿色

红色

13

包家花园芋

江西省

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿白

14

黄金坝乌禾

湖北省

多子芋

紫黑

淡紫

紫黑色

紫黑色

紫红

15

广昌槟榔芋

江西省

魁芋

紫色

绿色

绿色

绿色

红色

16

东乡白禾芋

江西省

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿白

17

江汉芋

湖北省

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿白

18

吉安毛子芋

江西省

多子芋

紫色

绿色

绿色

绿色

淡红

19

东乡红芽芋

江西省

多子芋

红色

紫色

乌绿色

乌绿色

深紫

20

湘潭迟芋

湖南省

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿色

21

舞阳芋

河南省

多子芋

绿白

绿白

绿白

绿色

绿白

22

波阳白芋

江西省

多子芋

绿白

绿白

绿白

绿色

绿白

23

董村芋

安徽省

多子芋

绿白

绿白

绿白

绿色

绿白

24

南京芋－10

江苏省

多子芋

绿白

绿白

绿白

绿色

绿白

25

湖南白禾芋

湖南省

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿白

26

五加山芋－1

广东省

多子芋

紫黑

淡紫

紫黑色

紫黑色

紫红

27

法泗白禾

湖北省

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿白

28

多头B

福建省

多头芋

红色

紫色

淡乌绿色

乌绿色

紫红

29

来风红梗

湖北省

多子芋

紫黑

淡紫

紫色

紫黑色

紫红

30

建宁槟榔芋

福建省

魁芋

紫色

绿色

绿色

淡红

红色

31

莱阳芋

山东省

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿白

32

走马羊

四川省

多子芋

紫色

紫色

紫红色

紫黑色

紫红

33

大冶湖芋

湖北省

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿色

34

福农1号

福建省

魁芋

紫红

绿色

绿色

淡红

   紫色

35

仙芋－3

湖北省

多子芋

绿色

绿色

绿色

乌绿色

淡红

36

鲁芋1号

山东莱阳

多子芋

绿色

绿色

绿色

淡红

绿色

37

日本石早

山东烟台

多子芋

紫红

绿色

绿色

淡红

绿白

38

日本叶用芋

山东烟台

叶用芋

紫红

紫色

淡紫

绿色

淡红

39

日本叶用芋

山东烟台

叶用芋

紫红

紫色

绿色

绿白

绿色

40

莱芋5号

山东莱阳

多子芋

紫红

淡紫

绿色

淡红

淡红

41

云南红芋

山东莱阳

花用芋

紫红

紫色

紫红

紫红

紫红

42

海芋

湖南祁阳

海芋属

灰白

灰白

灰白

灰白

灰白

43

白梗多子芋

湖南祁阳

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿白

绿白

44

紫梗叶用芋

湖南祁阳

叶用芋

紫色

紫色

绿色黑鞘

绿白

淡红

45

江永香芋

湖南江永

魁芋

紫黑

绿色

绿色

淡红

淡红

46

观赏芋

湖南祁阳

海芋属

绿色

绿色

绿色

绿色

绿色

47

祁阳香芋

湖南祁阳

魁芋

紫黑

绿色

绿色

淡红

淡红

48

绿梗叶用芋

湖南祁阳

叶用芋

紫色

紫色

绿色

绿白

绿色

49

绿梗多子芋

湖南祁阳

多子芋

绿色

绿色

绿色

绿色

绿色

1.2  芋基因组DNA的提取 （改良CTAB法）

提取液:100mmol/LTris.HCl（PH8.0）、20mmol/LEDTA(PH8.0)、2%CTAB(w/v)、1.4mol/LNaCl、1%β-巯基乙醇、2%PVP。具体实验操作如下：

⑴称取0.6g新鲜叶片（去叶脉），液氮研磨后，在研钵内加3mlCTAB缓冲液；

⑵用剪口并灭菌的1000μl Tip头分别吸取1ml研磨液放入两1.5ml离心管中，60℃水浴40min，裂解细胞，消化蛋白，在保温过程中，不时轻轻摇匀反应液；

⑶8000rpm/min离心3min；

⑷用移液枪吸取上清液并转入另一无菌离心管中,加等体积的氯仿:异戊醇(24:1,v/v)，缓慢摇匀,使之成乳状液,4℃11000rpm离心6min；

⑸取上清，加等体积氯仿:异戊醇(24:1，v/v)再抽提一次，4℃11000rpm/min离心8min；

⑹取上清,加入等体积预冷的异丙醇,温和倒转数次后,-20℃沉淀30min或过夜；

⑺用吸管将沉淀挑出，放入另一无菌离心管中，用70％乙醇冲洗2～3次，小心倒去液相，并用移液枪吸去多余的溶液，放入4℃冰箱干燥1h；

⑻加200μl TE缓冲液，再加1μl RNase酶，37℃水浴30～60min；

⑼加等体积氯仿:异戊醇(24:1，v/v),摇匀，4℃11000rpm/min离心5min；

⑽在收集到的上清溶液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，温和倒转几次，至出现白色絮状沉淀；

⑾将白色絮状沉淀转移到另一无菌离心管中，用70％乙醇洗涤沉淀2次，放入4℃冰箱内干燥；

⑿干燥完后，加50μl TE溶解沉淀。

1.3 DNA产量、质量的检测

取上述提取的DNA（2μl）用超纯水稀释50倍，在Berkman DU640紫外分光光度计上进行紫外线扫描检测和测定OD230、OD260、OD280 的读数，以证实DNA的真假和计算DNA溶液的浓度（每个样品取4次的平均值）。根据DNA的浓度计算样品中DNA产量、而用OD260/OD280 、OD260/OD280比值检测DNA的质量。

DNA浓度（μg/ml）=OD260×50×稀释倍数

DNA产量（μg/g）=DNA浓度×体积/提取DNA所需叶片的克数

取2μl标准分子量大小λDNA/HindⅢ为Marker和2μl上述方法提取的DNA样品，于1.0%琼脂糖上电泳，溴化乙锭染色后，在DOC-1000凝胶成像仪上进行观察并照相，以检测芋基因组DNA分子量的大小。

1.4 PCR扩增

根据所提取的基因组DNA的浓度，统一配制成浓度为10ng/μl的模板，用0.5ml离心管分装，-20℃储存备用。

在PTC-100TMPCR仪上进行PCR扩增反应，反应体积为25μl：

Buffer(Mg2+2.0mmol)                  2.5μl

dNTP                                0.5μl

Primer                              2.0μl

Taq polymerase                      0.5μl

模板DNA                            3.0μl

H₂O                                 16.5μl

矿物油                              20.0μl

反应程序为：

                39cycle

94℃  94℃

3min  1min             72℃   72℃

                       2min  5min

38℃

1min

                                4℃

                                ∞

1.5 琼脂糖凝胶电泳

各取12μlRAPD扩增的反应产物于1.8%琼脂糖上电泳，EB染色，电泳缓冲液为1×TAE，电场强度为2～3V/cm，电泳2～3小时，在DOC-1000凝胶成像仪上进行观察并照像，以检测扩增效果。

1.6 数据统计分析

1.6.1 数据统计  选择在全部供试材料中扩增出DNA多态性带的引物作为有效引物，其产物用作分析。采用将每一条带视为一个性状，按凝胶同一位置上DNA带的有无进行统计，有带记做“1”，无带记做“0”。在统计数据时，如果遇到有的条带因为个别材料分离不够清晰，而难以判断带的有无，就忽略掉这一条带的数据，以避免更多的人为误差。

1.6.2 利用Statistica软件进行聚类分析  用类平均法UPGMA(Unweighted Pair-Group Average)程序进行数据分析，首先计算出每个材料间的相似距离，然后获得相应的遗传关系聚类分析图。

2  结果与分析

2．1  引物筛选

参考表6-l中芋种质资源的形态学背景资料，选出差异较大的有代表性的3份材料，即江永香芋(槟榔芋)、莱阳孤芋(多子芋)和云南红芋(花茎用芋)。以这3份材料的DNA为模板，用100个随机引物对其进行RAPD扩增，从中筛选出DNA条带清晰可辨、多态性表现较为丰富的20个引物，引物编号和碱基序列见表6-2，再用这20个随机引物对全部49份芋材料的基因组DNA进行PCR扩增。

表6-2 引物、序列及芋种质资源RAPD位点多态性

Table 6-2  The primers used and the number of their

polymorphic bands of RAPD in taro

引物编号

Primer

序列

Sequence

扩增位点

Total bands

多态性位点

Polymorphic bands

多态率（％）

Polymorphic percentage

S146

AAGACCCCTC

14

12

85.7

S265

GGCGGATAAG

10

10

100.0

S276

CAGCCTACCA

7

6

85.7

S301

CTGGGCACGA

6

3

50.0

S111

CTTCCGCAGT

6

5

83.3

S439

GTCCGTACTG

8

8

100.0

S503

ACACAGAGGG

8

6

75.0

S249

CCACATCGGT

7

5

71.4

S159

ACGGCGTATG

9

6

70.0

S4

GGACTGGAGT

7

7

100.0

S68

TGGACCGGTG

8

6

75.0

S25

AGGGGTCTTG

8

7

87.5

S18

CCACAGCAGT

6

6

100.0

S246

ACCTTTGCGG

8

8

100.0

S17

AGGGAACGAG

7

4

57.1

S66

GAACGGACTC

6

6

100.0

S8

GTCCACACGG

6

5

83.3

S428

ACCTCAGCTC

7

7

100.0

S432

CACAGACACC

6

6

100.0

S433

AGCGTCACTC

6

4

66.7

合计

150

127

84.7

2．2  PCR扩增结果

用20个随机引物对49份芋材料进行基因组DNA的多态性分析，扩增出的DNA谱带的片段大小均在2500bp～300bp之间。图6-1，6-2为引物S265和S8扩增结果。根据数据统计分析采样原则，从20个引物产生的谱带中共获得150个位点，即DNA扩增片段，其中127个位点具有多态性，多态率高达84.7％。平均每个引物获得7.5个扩增位点，其中具有多态性的位点为6.35个。不同引物进行RAPD分析扩增出的位点数、多态性位点数和多态率见表6-2。在20个引物中，以引物S265、S146进行RAPD分析获得的多态性位点数最为丰富，检测效率最高，分别获得10，14个DNA扩增位点，                 10，12个位点具有多态性，多态率分别为100％、88.1％。引物S265,S439,S246,S4,S428,S18,S66,S432多态率均为100％，多态性位点数依次为10，8，8，7,7,6,6,6。多态率表现最低的是引物S301，也达到了50％。以上分析结果表明，从我国不同地区、不同生态环境下收集的不同类型的芋种质资源间存在着极为丰富的遗传多样性。

2．3  聚类分析结果

利用150个RAPD标记，用UPGMA法建立了49份芋材料间的遗传关系聚类分析图(图6-3)。

A1

A2

图6-1 49份芋材料的RAPD电泳图谱（引物S265＝A1，A2；）

Fig.6-1  The patterns of RAPD amplification in taro (primerS265=A1,A2)

B1

B2

图6-2 49份芋材料的RAPD电泳图谱（引物S8＝B1，B2）

Fig.6-2  The patterns of RAPD amplification in taro ( primer S8=B1,B2)

图6-3  49份芋材料的RAPD聚类分析图

Fig.6-3  Dendrogram of ciuster analysis for RAPD markers of

49 taro materials

从图6-3可以看出，49份芋材料明显地分成两大类群。第一类只包括两份材料，即海芋和祁阳花卉芋，他们的亲缘关系较近，遗传距离仅为3.0，同属于海芋属的观赏芋，显示出与其他47份芋属材料的明显差别。在第二类中，可将47份材料分为两组加以解释，第一组为从左边数起共16份材料，即从41至5。这16份材料又包括四大类型即花茎用芋、叶用芋、红芽芋和魁芋，此四类型依据遗传距离由远到近呈逐层降低式排列，他们两两间的遗传距离较远。其中，两份不同来源地的花茎用芋（10产于湖北省，41从云南省引到山东省种植的材料）被聚为同一类型，但遗传距离还是较远。魁芋类型的几个材料（47,45,34,15,5,）遗传距离比较近，其中祁阳槟榔芋（47）和江永香芋（45）不仅来源地接近，植物学性状相同，遗传距离（1.0）也很近，我们可认为其为同一品种不同名称；购自于马王堆菜市场的X3（5）和广昌槟榔芋（15）植物学性状与遗传距离接近，X3（5）极有可能就是广昌槟榔芋（15）。从日本引进的两份叶用芋材料（38,39）遗传距离相近，与我国的魁芋聚在一块。第二组共包括31份材料（自37至1），其中大部分材料的亲缘关系较近，基本可分为紫芋类（37,29,26,32,18,14,12,18）和绿白芋类（自43至1）。上述分类中也有个别材料仅仅依据植物学性状很难解释，如仙芋－3(35)、建宁槟榔芋(30)分别被聚到了叶用芋类、红芽芋类中。从以上分析结果可以初步看出，两份花茎用芋被聚到了一起，与叶用芋类的亲缘关系较近，其次为红芽芋、魁芋、紫芋类和绿白芋类。28,12为多头芋，与紫芋类的亲缘关系较近。在绿白芋类中（24～1），均为绿白多子芋类型，虽来自于不同省区，但由于长期在武汉芋资源圃中种植保存，植物学性状表现相同或相似，遗传距离很近。湖南著名的江永香芋（45），祁阳香芋（47）和福农1号（34）槟榔芋遗传距离最近。历史悠久的山东莱阳芋（2，4，7）介于紫芋类和绿白多子芋类之间，莱阳孤芋（2）、莱阳分芋（4）和莱阳花芋（7）很可能是来源于同一无性系的后代――南方绿白多子芋；原始类型可能为莱阳孤芋，它的子芋呈椭圆形，个体较大；有人将其引到北方的山东莱阳试种；由于数百年来长期栽培在较干旱的生态环境中，产生了一定的遗传变异，根据分子生物学的中性突变原理，莱阳花芋为趋中性变异的产物，它的子芋呈长椭圆形，个体较小；莱阳分芋却朝着有利于自身繁殖的方向发展，子芋呈细长筒型，个体明显变小，数量增多。在漫长的生物进化过程中，形成了独特的北方旱生多子芋类型；还需要有更多的证据和多学科的进一步论证。利用部分植物学性状基本能够解释以RAPD多态性分析为基础的聚类分析结果，但仅依据这些性状还不能够对芋的种质资源材料进行科学的分类。

3  讨论

（1）本实验所采用的CTAB改良法提取DNA，方法简便易行，提取周期短，所得DNA在质量和数量上均能满足RAPD分析的需要；是一种提取芋属植物DNA的有效方法。扩增体系反应的总体积小，所需试剂少，而扩增产物的量足够分析所用。因此，实验建立的反应体系经济可行，可为今后进一步研究芋属种质资源提供技术依据。

   经过反复比较优化筛选出本实验采用的PCR反应程序，产生的DNA条带清晰，多态性较高。与其他学者对其它作物的研究相比较〔9,10〕，能扩增出多态性产物的随机引物占所试用引物的比例较高，扩增出的多态性带占总带数的比例也高；这种高比例的多态性引物和多态性带提高了RAPD技术在芋属种质资源研究中的利用价值。

（2）在本实验中，海芋和观赏芋则为海芋属[Alocasia (Schott) G.Don]的两份材料。两者在聚类分析图中的亲缘关系较近，它们与芋属其它47材料遗传距离较远。尽管海芋属与芋属在外部形态上很相似，但从RAPD分析中，在DNA分子水平上却清楚地将二者分成两大类群。同时，将海芋属的材料用于芋属植物的RAPD分析中，亦是为提

为提高芋属植物的多态性表现的尝试。

（3） 用RAPD分析技术不仅可验证芋种下已确定的芋资源间的亲缘关系，对尚未确定其分类地位和来源不明的资源材料的归属问题也可提供分子水平的证据。如花茎用芋的进化途径以及分类地位等问题。两份食用花茎的红芋类被聚为同一类型；尽管它与叶用芋类的亲缘关系较近，但从形态上花茎用芋的叶柄细长，红色或绿色，叶片较小，近三角形；而与叶用芋类的叶柄粗壮、叶片较大差别较大；由于花茎用芋容易抽苔开花，从植物进化分类学的观点来看，应属于芋类的高级进化类型。从花茎用芋的生态分布来看，它适应于高湿度、高海拔的南方地区，而作者将其引种到较干旱、低海拔的北方地区（山东莱阳），它生长健壮，抽苔开花正常；说明这种进化类型的适应性较强。从芋的主食器官类型不同考虑，参考芋的形态学、分子标记以及芋民族植物学民间分类的观点提出：可以考虑将云南红芋一类主食花茎的芋作为芋的第三变种——花茎用芋变种；请有关学者进一步探讨。

（4）我国有着极其复杂多样的地理环境条件和丰富的植物遗传资源，芋又是一种主要以无性繁殖为主的蔬菜作物。本实验选用的49份芋材料是从武汉国家种质芋资源圃和作者在国际植物遗传资源研究所（IPGRI）的资助下，对我国云南、山东等省的芋资源进行调查和收集到的150多份材料中筛选出来的。从DNA水平进一步验证了我国芋种质资源丰富的遗传多样性，为芋资源的原生境保存提供了一定的理论依据。由于芋属植物的分类受到其多数种类不开花及无性繁殖的限制，我们根据芋种质资源的形态学观察，发现单用芋的来源、用途、生态位、叶柄颜色等性状只能进行初步的分类，但要研究芋的系统分类和科学分类，还需要了解更多的植物学性状、背景知识和分子水平上的分类依据。通过对RAPD扩增位点进行聚类分析，发现用部分植物学性状等背景资料结合聚类分析结果，有助于芋的种下分类系统的补充和调整，并能给予一定合理的解释。

参 考 文 献

1 中国农科院蔬菜研究所.中国蔬菜栽培学〔M〕. 北京：中国农业出版社，1987,319～328

2 普迎冬，杨永平，许建初等. 云南芋头种质资源及利用[J].作物品种资源，1999（1）：1～4

3 Li Qingdian, Li Ying, Huang Xinfang, et.al. Ethnobotany and Genetic Diversity of Taro in Shandong China〔J〕.湖南农业大学学报，2004，30(3)：220～224

4 漆小泉，朱德慰，沈镝，等. 大白菜和紫菜薹自交染色体组DNA的RAPD分析.园艺学报， 1995,22(3):256～262

5 杨保国，孔庆东.芋种质资源的分类研究[A].园艺学进展[C]，南京：东南大学出版社，1994：147～150

6  Zhang Dongxiao and Zhang Guman. Preliminary studies on evolution and classification of taro (Colocasia Spp.) in China[A].IPGRI, Ethnobotany and genetic diversity of Asian taro: focus on China[C], 1998:32～45

7 张志.芋的园艺学分类初探[J].中国蔬菜，1984（1）：30～32

8 蔡克华. 云南特产蔬菜－－红芋[J]. 长江蔬菜，1995（5）：20～21

9 许明辉，郑民慧，刘广田.烟草品种RAPD分子标记遗传差异的研究〔J〕·农业生物技术学报，1998，6(3)：281～285

10 吴敏生，王守才，戴景瑞·RAPD分子标记玉米杂种产量优势预测的研究〔J〕·遗传学报，1999，26(5):578～584