Triton X100洗涤剂对抗原包被效率的影响及其对策

      2008年07月10日 14:00:33 Thursday  333

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【摘要】  　　目的: 观察抗原中残留的洗涤剂成分在间接ELISA筛选阳性杂交瘤克隆时, 对抗原包被效率的影响以及相应的对策。方法: 以卵白蛋白（OVA）、卵运铁蛋白（OT）和本室制备的相应的单克隆抗体（mAb）作为实验模型, 在抗原中加入不同浓度梯度的Triton X100包被ELISA板, 用相应的mAb细胞株培养上清做间接ELISA, 确定Triton X100对包被效率的影响。结果: 当包被抗原中Triton X100的浓度为3×10-6（v/v）时, 可以明显抑制包被效率, 当Triton X100的浓度为1.6×10-4（v/v）时几乎可以完全抑制抗原的包被；在含有一定浓度Triton X100的条件下, 提高抗原的浓度, 或适当增大包被过程中的稀释倍数, 可以明显提高包被效率。结论: 洗涤剂对抗原包被有较强的影响, 在抗体制备过程中, 应尽量提高抗原的初始浓度, 降低洗涤剂的浓度, 设计合理的针对含有洗涤剂抗原的ELISA筛选方案, 是mAb制备成功的关键之一。

【关键词】  抗体 ELISA 洗涤剂

　　随着功能基因组研究的深入,  越来越多的基因表达蛋白作为免疫原用来制备特异性的单克隆抗体（mAb）,  但是部分原核或真核表达的蛋白在制备过程中会用到洗涤剂,  当用这些蛋白制备抗体时,  如果不注意其中残留洗涤剂的影响,  往往在间接ELISA筛选时出现“假阴性”结果,  导致大量阳性克隆的丢失,  甚至抗体制备失败。在用含有洗涤剂的抗原包被ELISA板时,  洗涤剂残留过高,  会严重影响蛋白质的包被效率,  但在保证含有一定浓度抗原的前提下,  适当稀释含有洗涤剂的抗原,  反而可以大大提高筛选的阳性率和阳性克隆ELISA检测的A值。我们用本实验室已有的卵白蛋白（Ovalbumin,  OVA）和卵运铁蛋白（Ovotransferrin,  OT）及其相应的mAb作为模型,  系统的研究了在抗原中加入洗涤剂Triton X100对包被效率抑制的程度、相应的浓度范围以及解决的方法。

　　1  材料和方法

　　1.1  试剂和仪器  OVA (Grade Ⅶ）和OT购于Sigma公司,  其相应的mAb antiOVA mAb No.12以及antiOT mAb No.2由本室制备。Triton X100购于华美生物公司,  96孔ELISA板购于CorningCostar公司,  辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig多克隆抗体购于Pierce公司,  显色底物ABTS购于Sigma公司,  酶标仪为BioRad公司产品。

　　1.2  缓冲液  （1）包被缓冲液: 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液,  pH9.5；（2）洗液: 0.15 mol/L PBS 加入体积比为0.5 mL/L的Tween20；（3）稀释液: 0.15 mol/L PBS加入体积比为30 mL/L的胎牛血清；（4）底物缓冲液: 0.1 mol/L柠檬酸盐磷酸盐缓冲液,  pH5.0；（5）显色液: 5 mg ABTS加入到10 mL底物缓冲液中,  再加30 mL/L H2O2  20 μL,  充分溶解。

　　1.3  方法

　　1.3.1  确定不同浓度的Triton X100对抗原包被效率的影响用包被缓冲液分别稀释OVA和OT至2 mg/L,  然后用稀释好的抗原稀释Triton X100,  从1∶5 000开始做倍比稀释至1∶320 000,  再用含有不同浓度Triton X100的2 mg/L的抗原包被ELISA板,  做间接ELISA,  确定不同浓度的Triton X100对抗原包被的影响。

　　1.3.2  Triton X100初始浓度相同的情况下不同抗原浓度对包被效率的影响  将OVA和OT用0.15 mol/L的PBS分别配制成1 g/L、 0.5 g/L、 0.25 g/L的抗原溶液,  然后加入Triton X100,  使其终浓度为10 mL/L。用包被缓冲液稀释抗原,  从64 mg/L开始做倍比稀释至0.125 mg/L,  包被ELISA板,  做间接ELISA,  观察在相同Triton X100浓度的条件下,  抗原浓度对抗原包被效率的影响。

　　1.3.3  间接ELISA  将包被缓冲液稀释好的抗原加入ELISA板,  100 μL/孔,  4℃过夜。洗液洗3遍,  加入相应mAb杂交瘤细胞株的培养上清（抗体浓度约为5 mg/L）,  100 μL/孔,  37℃孵育1 h,  然后用洗液洗3遍,  加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig多克隆抗体,  100 μL/孔,  37℃孵育45 min,  洗液洗3遍,  用ABTS底物液显色15 min,  在405 nm波长处用酶标仪读取吸光度（A）值。

　　2  结果

　　2.1  确定Triton X100对抗原包被效率产生影响的浓度范围在OVA和OT包被浓度都固定2 mg/L的条件下,  1∶5 000（1 mL/L的Triton X100稀释5倍）稀释的Triton X100几乎可以完全抑制蛋白的包被效率,  其A值与阴性对照相同。随着Triton X100浓度的下降,  吸光度值逐渐上升,   当Triton X100在1∶320 000的浓度下,  OVA和OT的A值分别为0.815和0.829,  是不含Triton X100抗原包被孔A值的47.10%和46.75%（OVA和OT的A值分别为1.73和1.773）,  表明即使Triton X100在1∶320 000的稀释度下,  对包被效率依然有较强的抑制作用（图 1）。

　　图1  不同浓度的Triton X100对抗原（2 mg/L）包被效率的影响（略）

　　阴性对照: 为包被缓冲液(不含抗原和洗涤剂);  无洗涤剂对照: OVA和OT抗原浓度均为2 mg/L(不含洗涤剂).

　　2.2  Triton X100对不同抗原浓度包被效率的影响  含有洗涤剂的抗原在包被时,  其包被的效率会受到抗原浓度和洗涤剂浓度两个因素的影响,  稀释倍数较低时,  虽然抗原的浓度较高,  由于洗涤剂的浓度也高,  包被效率极低；随着稀释倍数的提高,  洗涤剂的抑制作用减弱,  虽然抗原浓度逐渐降低,  在一定抗原浓度范围内包被效率却明显升高；以OT为例,  当Triton X100浓度等于或大于16×10-5（v/v）时,  16 mg/L的抗原浓度包被效率几乎为零；当Triton X100浓度为8×10-5（v/v）时,  抗原包被浓度越高,  A值越高,  如图2所示,  包被OT抗原的浓度为8 mg/L、 4 mg/L、 2 mg/L 时,  间接ELISA的A值分别为0.947、 0.826、 0.515；当Triton X100的浓度下降到2×10-5（v/v）时,  由于抗原的包被浓度下降,  包被效率明显下降,  但在不含Triton X100的同一抗原包被浓度下A值却高达1.536。

　　图2  Triton X100对不同抗原（蛋白）浓度包被效率的影响（略）

　　3  讨论
   
　　原核表达或真核表达制备蛋白抗原的过程中,  有一些操作方案会用到洗涤剂成分［1］。在原核表达系统中,  如果表达靶蛋白的目的只是用于生产抗体,  就不一定要获得活性蛋白,  而可以选择便于靶蛋白纯化的表达系统。包涵体的形成对不溶性蛋白的分离非常有利,  其变性之前要用Triton X100和EDTA或尿素洗涤,  目的是尽可能从聚集的目的蛋白中除去可溶的、黏附的细菌蛋白。为了获取可溶性蛋白,  需要将洗涤过的包涵体溶解,  在溶解包涵体的方案中,  Triton X100溶解是比较常用的方案。细胞裂解过程中,  洗涤剂成分用来防止蛋白聚集,  所以在谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白方案和用固化Ni2+吸收色谱纯化带组氨酸标签的蛋白方案中,  常用终浓度10 mL/L的Triton X100防止蛋白聚集,  既能溶解融合蛋白又不干扰之后的纯化过程［2］。真核表达系统中,  一些细胞裂解液的配方中也含有洗涤剂成分［3］。虽然在抗原的纯化过程中大部分洗涤剂成分被去除,  但是仍有可能在制备的抗原中有一定浓度的洗涤剂残存。我们的实验证实,如果抗原在制备过程中含有微量的Triton X100,  对抗原的包被效率会产生明显的影响,  会严重干扰了抗体的筛选和鉴定过程。
    　　
　　关于采用含有洗涤剂的重组蛋白作为免疫原制备mAb时,  如何提高杂交瘤筛选的阳性率,  有以下几点看法: （1）选择采用不加洗涤剂的重组蛋白纯化的技术路线；（2）必需要加入洗涤剂时,  力求选择对抗原包被影响小的洗涤剂,  或者尽量降低洗涤剂的使用浓度和提高基因表达产物的蛋白浓度［4］；（3）在评价使用含有洗涤剂的抗原免疫动物后的免疫血清效价时,  充分考虑洗涤剂对抗原包被效率的影响,  并结合对免疫血清的检测,  摸索出适合于杂交瘤筛选时含有洗涤剂的抗原包被的浓度,  以避免用间接ELISA筛选杂交瘤阳性克隆时可能发生的“假阴性”；（4）在抗原包被浓度和洗涤剂浓度相同的条件下,  使用具有不同蛋白吸附能力的ELISA板,  有时对抗原的包被效率会产生明显的影响,  因此应当选择吸附能力强的ELISA板（如CorningCostar公司和NUNC公司生产的可拆式ELISA板）。

【参考文献】
  　　［1］ 付 欣, 邹东霆, 周问渠, 等. F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23（9）: 856-858.

　　［2］ 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 DW（黄培堂, 等译）. 分子克隆实验指南［M］. 3版. 北京: 科学出版社, 2002: 1217-1270.

　　［3］ 萨姆布鲁克 J, 弗里奇 EF, 曼尼阿蒂斯 T（金冬雁, 等译）. 分子克隆实验指南［M］. 2版. 北京: 科学出版社, 1992: 870-872.

　　［4］ Gardas A, Lewartowska A. Coating of proteins to polystyrene ELISA plates in the presence of detergents［J］. J Immunol Methods, 1988, 106(2): 251-255.