养殖大菱鲆细菌性病原的鉴定及其免疫保护的初步研究

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大菱鲆(Scophthalmusmaximus)于1992年由黄海水产研究所引入国内，之后在我国迅速形成工厂化大规模养殖。随着养殖规模的不断扩大和集约化程度的不断提高，各种疾病接踵而至，特别是细菌性疾病，给水产养殖业造成严重的损失。 通过对2004年的黄海所病研室收录样品流行病调查发现了两种主要的细菌性疾病，依照外观症状，将它们称为出血症和溃疡症。这两种疾病死亡率高，常造成急性死亡。出血症的主要症状为早期体色变暗，平衡失调，不再摄食，少部分鱼还出现了在水中狂游现象；随着病情的发展，体表大面积出血，鳍条充血发红，严重时可溃烂，解剖可见肠胃空，肠壁严重充血，肝脏肿大呈土黄色或出现血斑，脾脏、肾脏肿大并稍微褪色。溃疡症症状主要表现为体表病灶部位出血、肌肉溃烂、眼球凸出等，解剖可见鳃丝贫血，肝脏充血，肾脏和胆囊肿大，肠壁充血并呈透明状，从出现发病症状起，大约一周后开始出现死亡。 从患出血症的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)体内分离到一株病原菌MN，革兰氏阴性，弯或直短杆状，具极生单鞭毛，可运动，TSB培养基上菌落半透明。生理生化特征测试结果表明，该菌与L.anguillarum极其相似，进一步对其16SrDNA序列进行分析和系统发育树的构建，结果显示MN菌与L.anguillarum自然聚类，亲缘关系最近。综合上述结果可将MN菌鉴定为L.anguillarum。用该菌感染牙鲆(Paralichthysolivaceus)，其半数致死量LD50=1.49×105CFU/尾鱼。药敏试验表明菌必治、头孢氨噻肟、罗美沙星等多种药物对所分离的病原菌有较强的抑制作用。 从患溃疡症状明显的病鱼中分离出优势菌并命名为H1，经人工感染证实H1即为引起本次养殖大菱鲆体表溃疡症的病原菌。对病原菌进行鉴定揭示该菌革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，极生单鞭毛。综合该菌在形态、生理生化、API20NE与API20E自动鉴定结果、16SrDNA同源性等方面的特性，确认H1为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，该菌对呋喃妥因、氯霉素、菌必治等多种抗生素敏感。哈维氏弧菌是海水养殖鱼类的常见致病菌，但作为养殖大菱鲆的病原菌属首次报道。 受免动物血清抗体效价是评价特异性免疫效果的一个主要指标，抗体效价的高低通常显示了免疫的成败。用0.5％的福尔马林灭活L.anguillarum制备灭活疫苗，采用腹腔注射法免疫牙鲆(P.olivaceus)，第一次免疫后50天进行二次免疫。取免疫后不同时间的牙鲆血清2倍系列稀释包被96孔酶标板，利用非放射性标记物地高辛(DIG)标记福尔马林灭活的L.anguillarum疫苗在适当缓冲液中与之结合，通过抗地高辛的酶标抗体显色系统，测定受免牙鲆特异性免疫应答水平。结果显示该间接ELISA法所测免疫组与对照组牙鲆抗体效价差异显著，且所测结果与凝集法所测结果变化趋势一致。从两种方法对试验组的抗体效价测定结果可以看出，地高辛标记抗原间接ELISA法的灵敏度比凝集法又较大的提高；与传统的ELISA法测定鱼类血清抗体效价相比，地高辛标记抗原间接ELISA法不需要制备兔、鼠或羊抗鱼的二抗且灵敏度相当或更高。以上结果表明地高辛标记抗原间接ELISA法具有较高的灵敏度，且操作方便，可以作为测定血清抗体效价的一个首创的新方法。 在我国，利用疫苗来控制淡水鱼类细菌性疾病，也已取得一定进展；而海水鱼类细菌性疾病疫苗的研究工作则刚刚起步，其研究和推广应用还需大量的工作。本研究针对海水鱼类常见细菌性病原L.anguillarum为研究对象，制备其灭活疫苗，对牙鲆进行了免疫效果的研究。试验结果表明，该L.anguillarum灭活疫苗两次腹腔注射接种牙鲆后，能够提高受免鱼非特异性免疫因子的活性，疫苗的接种对血清杀菌活力、溶菌活力和血细胞吞噬活力有较大影响，特别是对血清杀菌活力的影响最明显，建议对疫苗的非特异性免疫影响研究中以血清杀菌活力、溶菌活力和血细胞吞噬活力为主要评价指标；试验还表明疫苗诱导的抗体效价明显升高，免疫组血清抗体效价最高达1：4096～1：8192。用L.anguillarum对试验鱼攻毒后，实验组免疫保护率达76.9％，且发现受免鱼对副溶血弧菌也出现了一定的交叉保护性，免疫保护率为40.1％。