核酸化学

http://jpkc.hbmy.edu.cn/skyjpk/swhx/skja/02.htm

第二章  核酸化学（nucleic acid）

本章教学目的要求：

掌握核酸的种类和化学组成，DNA的一级结构的特点、表示方法及二级结

构要点和稳定因素，RNA的二级结构，核酸的主要理化性质，了解核酸的分布，DNA、RNA的三级结构，核酸分离纯化的一般方法和理化特性的应用。为进一步学习核酸代谢，遗传信息的表达打好基础。

重点、难点：

核酸的分子结构和主要性质，DNA的双螺旋结构模型和tRNA的“三叶草”结构。

 

第一节   核酸的种类分布与化学组成

 

一、核酸化学的兴起与发展

    核酸（nucleic acid）是一种具有复杂结构的生物大分子化合物，存在于一切生物的细胞中，是一种重要的生命物质，是细胞核的主要成分。

    1869年，瑞士的Basel（巴塞尔）大学的生理化学家Miescher（米歇尔）用胃蛋白酶水解在外科绷带上取得的化脓细胞，从细胞核分离出一种含磷的酸性物质，他称之为“核素”（核质）。即核酸和蛋白质的复合体。此后，科学家们相继在各种动植物组织中找到了这类核酸，并进一步分离其中的蛋白质，从而得到了核酸。以后开始了化学成分的研究。

    1885—1907年间，德国生理学家Kossel（柯塞尔）等对核酸化学组成进行了初步研究，发现核酸水解产物中有四种碱基：腺嘌呤胸腺嘧啶 尿嘧啶 野靛碱。其学生Levene（勒温尼）发现除了碱其外，还有核糖和磷酸，并于1929年发现还有一种失去一个氧原子的五碳糖——脱氧核糖。分别称为核糖核酸和脱氧核糖核酸。

    1930年以后，Levene继续研究了核酸的结构：一个核糖一方连着碱基，另一方与磷酸成酯，形成一个核苷酸单元。

    1944年—1951年，Avery等逐步证实了DNA是遗传信息的携带者。

    1953年，Watson ，Crick提出了DNA的双螺旋结构模型，使生物化学进入了分子水平时代。

    1958年，Meselson和Stahl用同位素标记证明DNA的复制方式是半保留复制。

    50年代以后，飞速发展，不仅分离出各种核酸，而且随着核酸测序（碱基序列）、人工合成所取得的成功，发展产生了遗传工程（基因工程）等生物技术，将越来越广泛地发挥作用。

    目前，基因结构及基因表达和调节已成为现代生物化学和分子生物学研究中心。

    1980年，生物学家、诺贝尔奖得主H.Dulbecco提出人类基因组计划，HGP，计划弄清楚人的23对染色体，30亿对碱基的排列顺序。

    1990年，美国决定用30亿美元、15年时间完成HGP，中国于1999年加入并承担1%测序任务（中科院遗传研究中心北京中心杨焕明教授，3号染色体短臂，3000万bp，30Mb），现已基本完成。

    后基因组时代：研究中心从揭示序列转移到整体水平对基因组功能的研究。产生了：

    功能基因组学：蛋白质组学，细胞内基因表达的所有蛋白质。

    结构基因组学：RNA组学，研究细胞全部功能RNA的结构、作用。

遗传图：

以具有遗传多态性的遗传标记为路标,以遗传学距离为图距绘制的基因组图。此处的遗传多态性定义为在某个遗传位点上具有一个以上的等位基因,且其在群体中出现的频率均高于1%。而遗传学距离则是指在减数分裂事件中,两个位点之间进行交换、重组的百分率,并规定1%的重组率为1ｃＭ。

 

物理图：

以一段已知核苷酸序列的DNA片段为标记,以Mb或Kb作为图距绘制的基因组图。该DNA片段称序列标记位置(sequence tagged site，STS)。

物理图的意义在于STS可把经典遗传学与细胞遗传学的位点信息转化为基因组位点的物理信息，基于STS位点信息的相连片段群又提供了研究区域的实验材料，以这些片段的材料便可进行该区域的基因组研究或在该区域寻找新基因。

 

转录图：

把mRNA先分离、定位，再转录成cDNA，这就构成一张人类基因的转录图，cDNA片段又称表达序列标签(exprossed sequence tag，EST)，因此转录图也称为表达序列图。

由于cDNA具有组织、生理与发育阶段的特异性，因此EST除提供序列信息外，同时也提供了该基因表达的组织、生理状况与发育阶段的信息。

 

序列图：

人类基因组核苷酸序列图即是分子水平的最高层次的、最详尽的物理图，由总长度为1ｍ左右、约由31亿核苷酸组成。当前人类基因组全序列图实际上是一个“代表性人类个体”的序列图，因为所有人类基因个体的基因位点都是相同的,不同族种、不同个体的基因差异,以及“正常”与“致病”基因的差异,只是同一位点上的等位基因的差异。

 

二、核酸的种类和分布

1、种类

脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid,DNA）、核糖核酸（Ribonucleic Acid,RNA）｛信使RNAmRNA、转移RNAtRNA、核糖体RNArRNA｝

2、分布

⑴DNA的分布

细胞生物：

原核细胞的DNA主要存在于拟核（类核）、质粒中。大肠杆菌中的环状双链DNA分子也叫染色体DNA。

 真核细胞的DNA主要存在于细胞核的染色质中，线粒体和叶绿体等少量细

胞器中亦有。

病毒生物：

部分病毒中分布有DNA。

⑵RNA的分布

90%的RNA存在于细胞质中，少量分布于胞核中。

部分病毒中分布有RNA。

三、核酸的化学组成

DNA、RNA都是以核苷酸为基本单元的大分子。核苷酸单元又由五碳糖、磷酸、碱基三者结合而成。

碱基

核苷

核酸       核苷酸          戊糖

磷酸

（一）五碳糖（戊糖，pentose）

DNA分子中的五碳糖为脱氧核糖，RNA分子中的五碳糖为核糖，这也正是把核酸分为RNA和DNA的根本依据。

结构有链式和环式两种。

（二）碱基（base）

核酸中的碱基分为两类：嘌呤碱和嘧啶碱

DNA分子中的主要碱基有四种：腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C、胸腺嘧啶T

RNA分子中的主要碱基有四种：腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C、尿嘧啶U

嘌呤（Purine）

嘧啶（Pyrimidine）

稀有碱基：又叫微量碱基或修饰碱基，是主要碱基的衍生物。

如次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、二氢尿嘧啶、咖啡因（1，3，7—三甲基黄嘌呤）、茶碱（1，3—二甲基黄嘌呤）、N⁶—甲基腺嘌呤（m⁶A）、N⁶—异戊烯基腺嘌呤（i⁶A）、N⁷—甲基鸟嘌呤（m⁶A）。

 

 

（三）磷酸

O                  O                    O

     ‖                 ‖       解离           ‖

HO— P—OH       HO— P —            — P—O－

      |                  |                     |

     OH                OH                  O－   

  磷 酸                磷 酰 基

 

 

（四）核苷（nucleoside）——戊糖与碱基结合物

1、核苷的形成

核苷由戊糖与碱基以“C—N”糖苷键结合而成。

核苷可以看成是嘌呤碱N⁹位或嘧啶碱N¹位上的H原子被戊糖基C₁位取代而成的化合物。

2、基本核苷的命名、符号

核苷名称由相应的碱基名和戊糖名加苷而产生，全名为“某碱基核苷”或“某碱基脱氧核苷”，并可简化为“某苷”或“脱氧某苷”。如腺苷、脱氧腺苷。

核苷符号依据相应碱基而来，对于脱氧核苷则在碱基代号前加“d”。

DNA、RNA分别有四种核苷

3、核酸中的稀有核苷（修饰核苷）

假尿苷ψ      胸苷T

缩写代号的表示方法:

（1）核苷的碱基上的H被其它基团取代的表示方法：

将碱基取代基、取代位置和取代基数目写在核苷单字代号（A、T、G、C、U）的左边，用小写英文字母代表取代基（甲基m、甲硫基ms、异戊烯基I、乙酰基ac、羟基o或h、羧基c、氨基n、硫基s）

如：m⁶₂A表示腺苷嘌呤环上的第6位有两个甲基取代基，即N₆，N₆-二甲基腺苷，右上角的数字为取代基在核苷分子碱基环上的位置，由下角的数字为取代基的数目。

甲基m

乙酰基ac

氨基n

甲硫基ms

羟基o或h

硫基s

异戊烯基i

羧基c

 

（2）核苷的糖分子中—OH基的H被其它基团取代后的产物的表示方法

在其核苷单字代号的右边加上代表取代基的小写字母代号，如：Am表示腺苷的第2位上OH基的H被甲基所取代。

（五）核苷酸（nucleotide）——核苷与磷酸结合物

核苷酸是形成核酸大分子的基本单元。可以将核苷酸看作核苷的磷酸酯。

核糖分子中除了C₁位—OH成苷外，还有C₂\C₃和C₅位三个自由羟基，可以分别生成相应位的核苷酸。

脱氧核糖分子中则还有C₃和C₅位两个自由羟基，能分别生成相应位核苷酸。

1、核苷酸的名称

某苷—（酯化位）—磷酸   或  （酯化位）—某苷酸

如：腺苷-磷酸   或   5′—腺苷酸

2、核苷酸的代号

一般以核苷号加“MP”形成 ，如5′—AMP。常见核苷酸多为5′—核苷酸，通常不写出酯化位置（5′略去）。如5—AMP写成AMP。

DNA和RNA分别有四种基本核苷酸。

四、细胞内的其他核苷酸及核苷酸衍生物

1、多磷酸核苷酸

常见的核苷酸为一磷酸单核苷酸，如5′—AMP。一磷酸核苷酸可与一分子磷酸结合成二磷酸核苷酸，如ADP；二磷酸核苷酸再与一分子磷酸结合成三磷酸核苷酸，如ATP。ADP ATP即为多磷酸核苷酸。

重要生理功能：

①参与能量代谢。ATP是能量通货；

②各种三磷酸核苷酸参与DNA、RAN的生物合成（作原料）；

③参与其它合成。如UTP参加糖转化、合成，CTP参与嘌呤、蛋白质的合成；

④作辅酶的结构成分。如NAD⁺、NADP⁺。

2、环化核苷酸

1950年Earl Sutherland（萨瑟兰德）在激素研究中偶尔发现腺苷3′，5′—一磷酸，即cAMP充当了激素第二信使的作用，并放大了激素信号。

另外 cGMP，有人认为它与cAMP的作用相拮抗。

cAMP                      cGMP

3、其他核苷酸

主要起调节作用，如：

ppGpp：鸟苷—5′—二磷酸—3′—二磷酸

pppGpp：鸟苷—5′—三磷酸—3′—二磷酸

A5′pppp5″A（Ap4A）：二腺苷—5′，5″—p′，p4四磷酸，

认为是体内的调节因子，因为蛋白质合成的第一步即氨基酸活化时形成，能代替ATP使氨基酸活化，使氨基酸连接到tRNA上去。在哺乳动物中与细胞生长速度之间有明显的联系，很可能是一种起促进作用的信号分子。

 

核酸在生命过程中起着携带和传递遗传信息的重要作用，但只有4种主要的核苷酸，如何完成这一任务呢？这与核酸的结构有关，即核苷酸的测序和空间结构。

 

第二节   DNA的分子结构

 

一、DNA的一级结构

（一）核苷酸之间的连接方式

一个核苷酸的3′—羟基和相邻一个核苷酸的5′—磷酸基团以酯键相连。把该键称为3′，5′—磷酸二酯键。

明确以下几点：

1、DNA、RNA各自的基本单元之间的连接都是如此，形成线形多核苷酸链；

2、无论核苷酸链有多长，总有两端：5′—端和3′—端；

5′—端：该末端的脱氧核苷酸5′位上的磷酸基团不再与另一个脱氧核苷酸相连。

3′—端：该末端的脱氧核苷酸3′位上是羟基，不再连接另一个脱氧核苷酸。

3、对DNA分子而言，其链上只有四种基本核苷酸。

（二）DNA的一级结构

1、DNA的一级结构及表示方法

DNA的一级结构是指DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序，也叫序列。

①各种DNA分子具有各不相同的核苷酸序列，即不同的一级结构。

②事实上，所有核酸链上的戊糖与磷酸是按一定规则交替重复的；无一定规则的是各种核酸链上的侧面碱基顺序。所以，分析核苷酸序列也即分析碱基序列，是分子生物学上的一个重要课题，并已取得了突破性进展。关于测序方法、原理参考：Stryer，L.生物化学，唐有祺等译，北京大学出版社，1990，459-461。

③关于核酸一级结构的表示

简化表示法：竖线表示戊糖碳链，原子编号自上而下，C₁连着碱基，A、T、G、C表示DNA中的四种碱基，P代表磷酸残基，磷酸二酯键自竖线中部引出（C₃）对角至相邻竖线下段（C₅），对角线中间为P，如：

 

DNA                                  RNA

缩写式：根据简化式从左至右按序写出碱基符号（代表核苷），以P代表磷酸基，P写在碱基符号左边时表示P结合在C₅位上，碱基符号右边的P表示与C₃结合。如：

…PAPCPGPT 

或    …PA—C—G—T

或    …PACGT

或    …PACGTOH

④简化式的读向：从左至右表示的碱基序列是5′      3′。

2、DNA的碱基组成规律-------Chargaff规则

1950年，Erwin Chargff（查尔加夫）用纸层析法分析多种生物DNA分子的组成成分，发现所有物种内的DNA的A与T，G与C之比值都接近1.0。他对DNA双螺旋结构模型的提出提供了重要依据。要点如下：

⑴碱基当量定律  同一种生物的不同组织或器官的DNA的碱基组成相同，并且，A与T的mol数相等，即A=T；A与C的mol数相等，即G=C，从而，A＋G=C＋T。

⑵不对称比率   不同种生物的DNA碱基组成存在差异。  

3、真核生物和原核生物DNA的区别

⑴真核生物：DNA和组蛋白结合；

原核生物：没有组蛋白。

⑵真核生物：主要分布在细胞核中；

原核生物：分布在拟核。

二、DNA的二级结构

（一）DNA二级结构的典型      双螺旋结构模型

1953年，Jamse.Wstson和Francis.Crick在前人研究的基础上，推导出DNA的双螺旋结构模型及DNA复制机制。

1、双螺旋模型要点

①两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴向右盘旋形成右手双螺旋；

②双螺旋的骨架是由磷酸和脱氧核糖组成，位于外侧，碱基位于螺旋内侧，配对平行，与轴垂直；

③双螺旋平均直径为20Å，螺距为34Å，螺旋一周包含10个碱基对，相邻碱基距离为3.4Å，之间旋转角度为36º；

④双螺旋结构上有两条螺形凹槽，大沟和小沟，对于DNA与PRO结合时的相互识别很重要，利于遗传信息的传递与表达。

⑤碱基按互补配对原则进行配对，A与T配对，之间形成两个氢键，C与G配对，之间形成三个氢键。

互补配对原则的重要性：

A：当一条多核苷酸链的序列被确定以后，即可推知另一条互补链的序列；

B：是遗传信息传递的分子基础，DNA的复制、转录、逆转录和翻译都以碱基互补原则为基础进行。

2、稳定DNA双螺旋结构的力

有利的：

（1）碱基堆积力：主要作用力，包括碱基之间的范德华力和碱基疏水作用。碱基堆积后，在双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，产生疏水作用。

（2）碱基对之间的氢键： 基本作用力

（3）离子键

不利的：

（1）静电斥力：磷酸基团之间；

（2）碱基分子内能。

平衡的结果。

3、生物学意义

第一次描述了DNA分子的结构，提出了遗传信息的储存方式以及DNA的复制机理，对DNA复制、基因遗传、RNA翻译、基因表达、调控等方面的研究都奠定了基础，揭开了分子生物学研究的序幕，为分子遗传学的研究奠定了基础。

见图

（二）DNA二级结构的多态性

指在不同提取条件下得到的同种DNA分子的二级结构亦不一定相同。

1、B-DNA：即DNA双螺旋结构模型，在92%相对湿度下对生理盐液抽出的DAN纤维的X-射线衍射图为依据。

2、A-DNA：75%相对湿度，以Na^＋、K^＋、、Cs作反离子。

3、C-DNA：66%相对湿度，以Li^＋作反离子。

    A、B、C—DNA均为右手双螺旋，只是大沟，小沟深浅，宽窄不一，碱基角度，螺距等不同。

4、Z-DNA   

1979年底，A.Rich等对人工合成的DNA片段制成晶体，经X射线衍射得到一种左手双螺旋，磷酸根和核糖的骨架呈现连写的Z字形，呈锯齿状，如“之”字而得名。它只有一个小沟。

在某些天然DNA中已发现了Z—DNA片段，并执行某种细胞功能，但不十分清楚，可能与基因调控有关。

B—DNA和Z—DNA之间可以相互转化。

并非所有DNA都呈双螺旋结构，如噬菌体DNA，单链。

5、三链DNA    DNA的三股螺旋

DNA三股螺旋简介

⑴在DNA双螺旋基础上形成。通常仅是一段三链区，而不是整个分子成三链。

⑵按来源分为：分子间三股螺旋（插入），分子内三股螺旋（双链之一回折）

⑶三链区的碱基配对：C≡G=C、C≡G=G、T=A=T、T=A=A。见图

应用意义及前景：利用插入第三链片段达到携带切割剂，从而定点剪切的目的；插入“第三股”达到破坏病毒等目的，都是阻止遗传信息的表达。

6、四链DNA

基本结构单元是鸟嘌呤四联体在不同盐浓度和湿度下形成不同的构象。

可能在稳定染色体结构以及复制中保持DNA的完整性等方面起作用。

三、DNA的三级结构-----------超螺旋结构

1、双链DNA在二级结构基础上进一步扭曲折叠形成三级结构。

2、环形双链DNA分子可以进一步扭曲成超螺旋结构，首尾可共价连接成环状，分为负超螺旋（“－”自下而上向左旋 ） 正超螺旋（“＋”自下而上向右旋），大多数天然存在的DNA分子都是负超螺旋。

3、超螺旋的作用：

（１）可以影响DNA双链的解螺旋。

当DNA双链螺旋与超螺旋方向相反时，促使双链解螺旋。如在DNA复制和RNA转录中。

（２）结构上使DNA有更紧密的形状，在组装中具重要作用。

比伸展的DNA分子更紧密，体积小。如：DNA长度为0.1----3100mm，而细胞大小只有1---10μm（原核）10---100μm（真核）。

见图

 

第三节   RNA的分子结构

 

一、RNA的一级结构

RNA的一级结构是指各核糖核苷酸在多核苷酸链上的连接顺序。

区别于DNA的是单核苷酸的种类不同。

二、RNA的空间结构

一般RNA的二级结构

RNA单链在空间结构上，没有DNA双链分子的规则的螺旋结构。但是，分析发现，许多RNA单链可以在许多区域发生单链自身的回折，同一链上的碱基配对，从而产生部分双螺旋结构和各种有一定代表性的空间构象。

在RNA双螺旋区域，碱基配对原则是：A-Ｕ，G-C之间形成氢键，不能配对的碱基所在区域则呈环状突起。

见图，tRNA的二级结构及三级结构

1、RNA分子具有统一的二级结构设计  

1965年Holley（霍利）测出第一个tRNA分子的碱基顺序------酵母丙氨酸tRNA的顺序。 三叶草形，约50%的碱基能配对。

共同特征如下：

⑴单链，含有74—93个核苷酸；

⑵含有较多稀有碱基（7—15）。它们是A、U、G、C的甲基、二甲基衍生物。如次黄嘌呤、一甲基次黄嘌呤、二氢尿嘧啶；

⑶5′端有磷酸残基，多为PG；

⑷3′端顺序为CCA—OH。在蛋白质合成中，tRNA转运氨基酸时就将活化氨基酸接在3′—OH上；

⑸一条多核苷酸链自身回折遇到能配对的碱基形成螺旋区（臂或茎）；不能配对的地方形成突环区（环），形成四环四臂结构  

呈三叶草形：

①氨基酸臂（接受茎）：七对碱基，末端为—CCA，能接受活化的氨基酸；

②二氢尿嘧啶环（DHU环或D环）：8—12个核苷酸，因具两个二氢尿嘧啶而得名。与分类有关，通过二氢尿嘧啶臂（D茎）与其它相连；

③反密码环：7个核苷酸，中部为反密码子，与mRNA密码子配对。通过反密码茎与其它相连；

④额外环：3—18个核苷酸，是tRNA分类的依据。

⑤TψC环 ：7个核苷酸，可能与在核糖体处落下有关。通过TψC臂与其它相连。

2、tRNA的三级结构

在20世纪70年代中期，以Rich等率先对tRNA晶体结构进行X-光衍射研究。

呈倒“L”形，3—CCA—ＯＨ末端位于L的短线一端，反密码环位于L的长线一端，DHU和TψC环形成L的转角。

作用力：

（１）氢键和碱基的上下堆积，以及疏水性等使得倒“L”结构稳定存在。

（２）除了碱基对的氢键外，还有非寻常的氢键：不互补的碱基间G—G、A—A、A—C等的氢键；核糖磷酸骨架与碱基骨架之间的氢键。

见图

（三）mRNA的结构特征

mRNA一般呈单链，分子大小不一。可以自身回折成一般RNA的二级结构，如发夹式。

据研究，真核mRNA是在细胞核及线粒体中产生，然后进入细胞质和核糖体的。

由于mRNA在代谢上较不稳定，故分离和测定方法上存在一些问题，用不同方法测得的大小各异。

真核生物细胞中mRNA的特征结构：

1、3′—PolyA尾：在3′端有一段约20—200个腺苷酸组成的多聚腺苷酸。它能提高mRNA的稳定性。使之顺利进入细胞质，并转移到核糖体。

2、5′—帽子结构：7—甲基鸟苷（m⁷G）以5′—5′焦磷酸键连接于mRNA的5′端；邻近的核糖2′—OH亦可—CH3化形成帽子。  帽子结构可以保护mRNA5′端不被5′核糖核酸酶等水解，从而提高mRNA的稳定性。可能与蛋白质合成有关，因为mRNA须与核糖体40s亚基结合。

3、原核细胞和真核细胞mRNA在结构上的不同：

                     原核细胞                    真核细胞

顺反子多少        多，可编码多条肽链              单顺反子

帽子结构               没有                         有

3′—PolyA             没有                         有

（四）rRNA的结构

存在于核糖体中，占其重量的2/3，与蛋白质结合。

单链，有螺旋区，发夹形结构，构象不稳定。

核糖体由大小两个亚基组成，均含有rRNA。原核生物：30S（16srRNA）、50S（５s、23srRNA）；真核生物:40S（18srRNA）、60S（5s、5.8s、28srRNA）、。

主要功能：是形成核糖体，作为蛋白质合成的场所。

现已发现：某些rRNA具有酶的功能，叫做核酶。

(五)核内小分子RNA（snRNA）

只存在于真核生物细胞中，只有100—200个核苷酸。

能与一些特殊的蛋白质形成稳定的复合物（核内小分子核糖蛋白体snRNP），在真核生物基因转录产物（核内不均一RNA、hnRNA）加工为成熟mRNA中起重要作用。

 

第四节 核酸的理化性质与分离提纯和应用

 

一、一般性质

（一）            一般物理性质

 

 

 

 

 

核酸

性质

DNA

         RNA

纯品物理状

白色粉末

白色纤维状

溶液粘度

小

大

分子大小

大

1.6×10⁶D——

2.2×10⁷D

小

tRNA  25000—30000D

mRNA  0.5×10⁶D

rRNA   0.6—1.8×10⁶D

溶

解

性

水溶性

微溶

微溶

盐溶性

易溶

易溶

有机溶剂

不溶（75%C₂H₅OH↓）

不溶（50%C₂H₅OH↓）

 

（二）两性性质

由于核酸，核苷酸中含有碱基和磷酸基，而呈两性电离，是两性电解质。磷酸基比碱基更易解离，故核酸表现为酸性。

（三）核酸的水解

在一定条件下，磷酸二酯键、糖苷键被破坏，核酸可水解成核苷酸，核苷，碱基，戊糖，磷酸等各种成分。

1、碱水解：室温，稀碱下，RNA可水解为核苷酸；DNA不能水解。

2、酸水解：稀酸长时间或高温或强酸处理核酸，可促使核酸发生糖苷键、二酯键水解。

3、酶水解：核酸酶、核苷酸酶等，详细见“核酸代谢”。

（四）沉降特性

由于溶液中的核酸在离心场中可下沉，因而可用超离心法纯化核酸，沉降速度有差异：RNA>环形DNA>线形DAN>PRO或将不同构象的核酸分离，也可测沉降系数和分子量。

RNA：蔗糖梯度超离心

DNA：氯化铯梯度超离心

（五）粘度

DNA粘度比RNA大。当受热或其他因素，由螺旋变为无规则时，粘度下降，可作变性指标。

 

二、核酸的紫外吸收性质

由于核酸分子中具有的共轭双键体系（单双键交替的键），而导致核酸具紫外吸收特性，对240nm—290nm的紫外线有强烈吸收峰，最大吸收峰在260nm。

DNA的减色效应：在核酸的紫外吸收特征上，对于DNA而言，DNA分子的紫外吸光率小于形成该DNA分子的各单核苷酸的吸光率之和。这种现象叫减色效应。

DNA的增色效应：如DNA双螺旋结构发生解螺旋（如高温），使分子中碱基堆积程度下降，从而发生紫外吸光率增加。这种现象叫增色效应。

利用紫外吸收特性可以分析核酸的变性和复性等。用紫外分光光度计测定含量，鉴定纯度，在分光光度计上读出A260、A280（光密度值D）

A260/A280可判断样品的纯度，纯DNA>1.8、纯RNA>2.0。

 

三、核酸的变性与复性 分子杂交

（一）核酸的变性

1、核酸的变性的概念

指核酸的双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂，分子量不变，一级结构不发生变化。

2、变性因素：加热、酸碱度改变、有机溶剂、酰胺、尿素等。

3、变性表现：增色效应；双螺旋解体，形成无规则线团，粘度下降，浮力密度升高；部分或全部失去生物活性。

见图

4、解链温度T_m

通常把DNA的变性达到50%，即增色效应达到一半时的温度称为该DNA的解链温度。

DNA的热变性一般在较窄的温度范围内发生，就像固体结晶物质在熔点突然熔化的情形一样，所以常将热变性称为“溶解”；而将热变性温度称为“熔点”或“解链温度”，以T_m表示，或以T1/2表示，意为DNA失去一半双螺旋时的温度。DNA的T_m值在82—95℃之间。

核酸分子中一般以GC碱基对较AT碱基对稳定，故富含GC碱基对的DNA的T_m值相对高，因此测定T_m值可以粗略推算碱基对的含量。

见图

（二）DNA的复性

变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋，这个过程叫DNA的复性。

复性表现：许多理化性质可恢复，生物活性得以部分恢复。但是条件较复杂：

1、热变性的DNA骤然冷却不可能复性，缓慢冷却时可复性。（退火：通常将因温度升高引起DNA变性，而后变性DNA随降温而复性的过程）

2、DNA大小。DNA片段越大，复性越慢。 因为太大片段在介质中由于扩散的问题， 寻找互补链机会大大减少，往往不能准确和快速的重新结合。

3、DNA浓度。DNA浓度越大，复性越快。因为两条互补链彼此相遇的可能性越大， 复性速度会越快。

4、离子强度。增加盐浓度，两条互补链重新结合的速度加快，因为盐能中和两条单链中的磷酸基团的负电荷，减少负电荷的互补单链的相互排斥。

见图

（三）分子杂交(hybridization)

两条来源不同但有核苷酸互补关系的DNA单链分子，或DNA单链分子与RNA分子，在去掉变性条件后互补的区段能够退火复性形成双链DNA分子和DNA/RNA异质分子。

基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间,也可在RNA与DNA链之间形成。

杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性(加热或碱处理)使双螺旋解开成为单链,因此,变性技术也是核酸杂交的一个环节。

应用：鉴定核酸分子之间的同源性，在分子生物学，分子遗传学中应用广泛。

若杂交的目的是识别靶DNA中的特异核苷酸序列,这需要牵涉到另一项核酸操作的基本技术─探针(probe)的制备。

“探针”（Probe）新技术：探针是指带有某些标记物(如放射性同位素³²P,荧光物质异硫氰酸荧光素等)的特异性核酸序列片段。

若我们设法使一个核酸序列带上³²P,那么它与靶序列互补形成的杂交双链,就会带有放射性。以适当方法接受来自杂交链的放射信号,即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别。在现代分子生物学实验中,探针的制备和使用是与分子杂交相辅相成的技术手段。核酸分子杂交作为一项基本技术,已应用于核酸结构与功能研究的各个方面。在医学上,目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断(gene diagnosis),恶性肿瘤的基因分析,传染病病原体的检测等领域中,其成果大大促进了现代医学的进步和发展。

将另需待测DNA经变性后，与探针一起保温，发生杂交，如能杂和成双链，则二者有同源性，碱基互补。应用遗传病诊断。

 

四、核酸的分离提纯

自学，关于核酸分离，纯化的方法不只一种，而且专业性较强，

并因提取材料各异，详细请参考实验指导书。

第五节   核蛋白

核酸与蛋白质结合成为核酸-----蛋白质复合物，称为核蛋白。

一、核糖体

又叫核糖核蛋白体，核蛋白体，由蛋白质和rRNA组成。

二、病毒

是细胞内寄生物，虽有蛋白质和核酸，但是不具备生活细胞所必需的能量生成代谢和蛋白质合成功能，本身不能繁殖，能引起多种疾病。只含有一种核酸（DNA或RNA）。

三、核小体    

由真核细胞的DNA与组蛋白结合成的核蛋白。

组蛋白是碱性蛋白，富含Arg 和Lys，约1/4。分为五类：H₁、H_2a、H_2b、H₃、H₄

一系列的核小体重复单位组成染色质丝，染色质折叠成染色体。

核小体由H_2a、H_2b、H₃、H₄各两分子组成的八聚体和DNA的160—240个碱基对构成。140个DNA碱基对绕组蛋白八聚体外围盘绕1.75圈，剩余DNA连接在相邻核小体核心之间，组蛋白H₁结合其上，看起来似一串珠子。